Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur umgekehrten Polytransfektion von embryonalen Stammzellen der Maus während der Kultur mit 2i- und LIF-Medien. Diese Methode bietet eine höhere Durchführbarkeit und Effizienz als herkömmliche Vorwärtstransfektionsprotokolle und ermöglicht gleichzeitig eine Ein-Topf-Optimierung der Plasmidverhältnisse.