Overview
A purificação de gel é usada para recuperar fragmentos de DNA após a separação eletroforética. A recuperação de DNA de um gel de agarose inclui três passos básicos: ligação, lavagem e eluição de uma coluna de sílica. Acredita-se que o DNA se liga à sílica na presença de sal alto através de uma ponte de sal. Após a ligação, o DNA é lavado de impurezas e elucido sob condições de baixo sal interrompendo essa interação.
Este vídeo passa por um procedimento passo-a-passo generalizado para cortar uma banda do gel, solubilização de gel, purificação através da ligação a uma coluna de sílica, e elução de DNA purificado. Além disso, a apresentação discute várias dicas para garantir a purificação bem sucedida do gel, incluindo a importância de executar um gel de agarose com um marcador ou escada que tenha DNA de tamanhos conhecidos.
Procedure
A purificação de gel é um procedimento padrão realizado para recuperar fragmentos de DNA desejados de géis agarose após separação eletroforética. Depois de dissolver o fragmento de gel e executá-lo através de um filtro especializado, este procedimento produz DNA livre de impurezas como sais, nucleotídeos livres e enzimas, adequados para aplicações a jusante.
O princípio básico por trás da recuperação de DNA do gel de agarose envolve uma sequência de passos de ligação, lavagem e elute. Uma vez que o gel está em tampão solubilizador, ele é aplicado em uma "coluna de spin", que, após a centrifugação, permite que as moléculas de DNA se liguem seletivamente a um filtro de sílica enquanto as impurezas fluem através de um tubo de coleta.
O DNA é capaz de se ligar à sílica graças a uma alta concentração de sal no tampão de solubilização de gel. Acredita-se que este buffer interrompa a estrutura de hidratação ao redor do filtro e crie uma ponte de sal entre as fortes cargas negativas no filtro e cargas negativas no DNA. Impurezas residuais são removidas por lavagem com etanol.
A água ou o tampão de sal baixo são adicionados à coluna e "elute", ou livre, o DNA dele, presumivelmente interrompendo a ponte de cáção. O DNA está agora purificado do gel.
O primeiro passo no procedimento de purificação de gel envolve a fundição do gel de agarose e a realização de eletroforese das amostras de DNA. Uma vez que o gel-run é completo, fragmentos de DNA desejados são visualizados contra a luz UV e fragmentos são selecionados após comparação com um padrão de peso molecular.
Se o gel não estiver manchado, a localização da banda pode ser aproximadamente determinada com base em uma comparação com a escada de DNA. Ao cortar o gel com uma lâmina de barbear, deve-se tomar cuidado para recuperar o máximo de DNA possível com o mínimo de agarose possível.
Ao manusear géis manchados de brometo de ethidium e trabalhar na frente da luz UV, luvas e óculos de proteção devem ser usados. Depois de cortar o DNA desejado do gel, descarte o gel e o buffer de execução corretamente, em conformidade com os protocolos de segurança institucionais.
Uma vez isolado, o pedaço de gel é colocado em um tubo de microfuge e pesado em um equilíbrio. Usando a aproximação de que 100 mg de gel ocupa 100 l, um volume de tampão de solublilização que é 4X o peso do gel é adicionado à peça de gel. Após ser colocada em tampão, a peça de gel é incubada em torno de 50 C para derreter a agarose.
Uma vez derretido, o gel solubilizado é adicionado em uma coluna de spin e a solução é centrifurada, o que fará com que todo o DNA e outras partículas grudem no filtro.
Em seguida, o DNA vinculado é lavado adicionando 70% de etanol ao filtro, seguido de centrifugação, que removerá impurezas residuais do filtro. O fluxo é descartado, e esta etapa de lavagem é então geralmente repetida até três vezes. O filtro vazio é girado novamente para remover o etanol residual, e o filtro de sílica é permitido secar à temperatura ambiente. O tampão de água ou elução é adicionado ao filtro, e com outra rodada de centrifugação, o DNA purificado é coletado na parte inferior do tubo.
O método que você acabou de ver se aplica à purificação de gel com filtros de coluna de giro de sílica. Existem outros métodos que fazem uso dos mesmos princípios básicos de vinculação do DNA à sílica seguidos de etapas de lavagem e eluição. Por exemplo, a sílica pode ser misturada com DNA em uma suspensão chamada "glassmilk", que pode ser pelleted e lavada, e posteriormente eluida. Além disso, a sucção pode ser usada para extrair DNA através de filtros de sílica e, mais tarde, elute-lo. Certifique-se de entender os procedimentos de purificação de gel do seu laboratório.
Agora que você aprendeu como recuperar DNA de géis de agarose, vamos examinar algumas aplicações a jusante que usam DNA obtido a partir da purificação de gel.
Por exemplo, a purificação de gel é um passo intermediário na Imunoprecipitação Chromatina, uma técnica que visa isolar as proteínas regulatórias que agregam DNA genômico, a fim de identificar quais sequências estão sendo reguladas. Os fragmentos isolados são purificados em gel e sequenciados, a fim de serem mapeados nas regiões do cromossomo individual.
Subcloning - o processo de mover um gene em um vetor para outro - pode envolver a purificação de gel. Por exemplo, sequências genéticas de um vetor podem ser digeridas a partir de uma construção, e montadas em sequências quimricas via PCR, após as quais são purificadas em gel e colocadas em outras construções.
Talvez a aplicação mais simples da purificação de gel seja seu uso após armazenamento a longo prazo a -80 °C de bandas de DNA excisadas após a eletroforese.
Agora você aprendeu como extrair fragmentos de DNA do gel de agarose, as variações de procedimentos de ligação, lavagem e elute seguidos de acordo com a preferência individual do usuário, e finalmente algumas das possíveis aplicações a jusante deste método. Como sempre, obrigado por assistir.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
