Dieses Protokoll demonstriert die Durchführung eines Einzelmolekül-Assays zur Live-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase. Sie beschreibt (1) die Herstellung eines DNA-Substrats, (2) die Reinigung der fluoreszenzmarkierten Drosophila melanogaster CMG-Helikase, (3) die Vorbereitung einer mikrofluidischen Durchflusszelle für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) und (4) den Einzelmolekül-DNA-Entwindungsassay.
Eine originalgetreue Genomduplikation ist unerlässlich, um die genetische Stabilität der sich teilenden Zellen zu erhalten. Die DNA-Replikation wird während der S-Phase durch einen dynamischen Komplex von Proteinen durchgeführt, der als Replisom bezeichnet wird. Das Herzstück des Replisoms ist die Helikase CDC45-MCM2-7-GINS (CMG), die die beiden Stränge der DNA-Doppelhelix so trennt, dass DNA-Polymerasen jeden Strang kopieren können. Bei der Genomduplikation müssen Replisomen eine Vielzahl von Hindernissen und Herausforderungen überwinden. Jede dieser Faktoren gefährdet die Stabilität des Genoms, da das Versäumnis, die DNA vollständig und genau zu replizieren, zu Mutationen, Krankheiten oder Zelltod führen kann. Daher ist es von großem Interesse zu verstehen, wie CMG im Replisom sowohl während der normalen Replikation als auch unter Replikationsstress funktioniert. Hier beschreiben wir einen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie-Assay (TIRF) unter Verwendung rekombinanter gereinigter Proteine, der eine Echtzeit-Visualisierung von oberflächengebundenen, gestreckten DNA-Molekülen durch einzelne CMG-Komplexe ermöglicht. Dieser Assay bietet eine leistungsstarke Plattform zur Untersuchung des CMG-Verhaltens auf Einzelmolekülebene, so dass die Dynamik der Helikase direkt beobachtet werden kann und die Reaktionsbedingungen in Echtzeit gesteuert werden können.
Die DNA-Replikation ist streng reguliert, da eine Zelle ihr Genom genau duplizieren muss, um Mutationen, Krankheiten oder Tod zu verhindern. Die Replikation der eukaryotischen DNA erfolgt durch den Replisomenkomplex, der die elterliche DNA abwickelt und einzelsträngige DNA (ssDNA) als Vorlage für die Synthese neuer DNA verwendet. In der G1-Phase werden katalytisch inaktive Doppelhexamere von MCM2-7 an den Replikationsursprüngen1 auf doppelsträngige DNA (dsDNA) geladen. In der S-Phase werden MCM2-7-Komplexe durch die Bindung von CDC45 und GINS2 aktiviert, um CMG-Komplexe mit 11 Untereinheiten (CDC45, MCM2-7, GINS) zu bilden. Jedes CMG initiiert die DNA-Entfaltung in entgegengesetzte Richtungen und bildet die Kerneinheit, um die sich das Replisom herum anordnet3.
Vor zwei Jahrzehnten wurde die CMG-Helikase erstmals als ein Komplex aus 11 Untereinheiten identifiziert, der für die DNA-Replikation unerlässlich ist4. Seitdem hat sich unser Verständnis von CMG erheblich weiterentwickelt, von der Beladung und Aktivierung 5,6 bis hin zur DNA-Entwindung und -Beendigung7. Traditionelle biochemische und strukturbiologische Techniken waren für viele dieser Entdeckungen von entscheidender Bedeutung. Diese Methoden waren jedoch oft nur begrenzt in ihrer Fähigkeit, die dynamischeren Aspekte der CMG zu untersuchen. Einzelmolekülmethoden nutzen die physikalische Manipulation einzelner Biomoleküle, um ihre Aktivität Molekül für Molekül zu messen oder zu visualisieren. Dies kann genutzt werden, um Einblicke in die Echtzeitdynamik von Proteinen zu erhalten, die mit anderen Techniken oft übersehen oder nicht nachweisbar sind 8,9.
Hier beschreiben wir einen Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskopie-Assay (TIRF), um die DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase in Echtzeit zu visualisieren. Gereinigtes, fluoreszenzmarkiertes CMG wird auf das freie 3′-Ende der langen DNA geladen, die eine vorgefertigte DNA-Gabelstruktur enthält. Lineare DNA wird auf einem Biotin-PEG-Deckglas in einer mikrofluidischen Durchflusszelle gedehnt, indem jedes Ende der DNA nacheinander an die Oberfläche gebunden wird. Dieser Ansatz ermöglicht ein einheitlicheres DNA-Tethering, wodurch die Variation, die bei der Datenanalyse berücksichtigt werden muss, erheblich reduziert wird. In Gegenwart von ATP-γ-s wird CMG auf die einzelsträngige DNA am 3′-Ende der Gabel geladen. ATP-γ-s ist ein langsam hydrolysierbares ATP-Analogon, das die Bindung von CMG an die DNA ermöglicht, sich aber nicht abwickelt. Die anschließende Zugabe von ATP zusammen mit gereinigtem, fluoreszenzmarkiertem RPA aktiviert CMG und leitet eine umfangreiche DNA-Entwindung ein. Visuell transloziert CMG entlang der DNA und hinterlässt einen wachsenden Trakt RPA-gebundener ssDNA. Das ungebundene DNA-Ende bewegt sich mit CMG und bildet aufgrund der durch RPA-Bindung verursachten Verdichtung einen “engen Ball”. Das Design der Durchflusszelle ermöglicht es, den Puffer während des Abwickelns jederzeit auszutauschen, was eine hervorragende Kontrolle während und über jedes Experiment bietet.
Dieses Protokoll ist in vier Methoden unterteilt, die unabhängig voneinander durchgeführt werden können. Abschnitt 1 beschreibt die Herstellung eines 20 kb linear gegabelten DNA-Substrats für Einzelmolekül-Assays. Abschnitt 2 beschreibt die Aufreinigung und Fluoreszenzmarkierung von Drosophila melanogaster CMG (DmCMG). Wichtige Informationen über die Ausprägung von DmCMG finden Sie im Abschnitt “Hinweise”. Abschnitt 3 befasst sich mit der Vorbereitung einer mikrofluidischen Durchflusszelle, die an einem TIRF-Mikroskop verwendet werden kann. Abschnitt 4 beschreibt, wie der Einzelmolekül-DNA-Entwindungsassay durchzuführen ist.
Dieser Assay bietet eine Plattform, um die Echtzeitdynamik einzelner CMGs sowohl isoliert als auch im Kontext der gewünschten zusätzlichen Faktoren zu beobachten und zu untersuchen. Wie bei vielen Einzelmolekül-Fluoreszenztechniken gibt es jedoch einige häufige Herausforderungen, die optimiert werden müssen, um sie zu bewältigen. Diese beziehen sich in der Regel auf die Abbildung von Fluorophoren über lange Zeiträume (Photobleichung, Helligkeit), die DNA-Substratvorbereitung (DNA-Schäden), die Qualität der Oberfläche der Flusszelle (Hintergrundrauschen, unspezifische Wechselwirkungen) oder die Qualität der gereinigten Proteinpräparation (Nukleasekontamination, Markierungseffizienz).
Jedes Fluorophor variiert in seiner Photostabilität und Helligkeit, daher ist es wichtig, ein geeignetes Molekül auszuwählen. Bei der Abbildung von fluoreszenzmarkierten oligomeren Proteinen wie RPA kann eine geringere Laserleistung verwendet werden, da viele Fluorophore in unmittelbarer Nähe angeregt werden und ein sichtbares Signal erzeugen. Für die Abbildung einzelner Fluorophore, z. B. CMG, die auf einer einzelnen Untereinheit markiert sind, ist eine höhere Laserleistung erforderlich, um das Fluorophor klar zu beobachten. Die Lebensdauer von Fluorophoren kann durch Minimierung der Laserbelichtung verlängert werden, z. B. durch Verringerung der Häufigkeit, mit der Bilder aufgenommen werden. Darüber hinaus erzeugt die Anregung eines Fluorophors reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die zur Photobleiche beitragen können. Die Aufnahme eines Sauerstofffängersystems in den Bildgebungspuffer kann die Lebensdauer von Fluorophoren verlängern, indem ROS eliminiert werden. Einige Sauerstofffängersysteme können jedoch denpH-Wert von 12 beeinflussen.
Bei der Präparation von DNA-Substraten ist es entscheidend, DNA-Schäden, wie z.B. Kerben oder einzelsträngige Lücken, zu minimieren. Übermäßige Beschädigung verhindert eine umfangreiche DNA-Entkopplung, was die Menge an Daten, die gesammelt werden kann, einschränkt. Schäden können durch mechanische Scherung, übermäßige Erwärmung als Folge von Nukleasekontamination oder ROS entstehen, die während der Bildgebung entstehen. Das Scheren kann minimiert werden, indem die DNA-Probe vorsichtig gehandhabt wird, indem Spitzen mit breiter Öffnung zum Pipettieren verwendet werden, langsam pipetiert wird und ein Schnippen der Probe vermieden wird. Der Effekt von ROS kann minimiert werden, indem entweder die Laserbelichtung reduziert oder ein Sauerstoffabscheidesystem in den Bildgebungspuffer aufgenommen wird. Nach der Vorbereitung des DNA-Substrats ist es möglich, kommerzielle DNA-Reparaturkits zu verwenden, um den Schaden zu reparieren, bevor eine Abwickelreaktion durchgeführt wird.
Die Effizienz der DNA-Entwindung hängt auch von der Reinheit und Aktivität von CMG ab. Es empfiehlt sich, die Reinheit der Probe nach jedem Aufreinigungsschritt durch SDS-PAGE-Elektrophorese zu beurteilen, um festzustellen, wo eine Optimierung erforderlich ist. Wenn nach dem letzten Schritt zu viele Verunreinigungen beobachtet werden, kann es hilfreich sein, die Salzgradientenvolumina zu modifizieren, die für die Elution aus der CaptoHiRes Q (5/50)-Säule verwendet werden. Es ist auch sehr wichtig, überschüssiges fluoreszierendes Peptid, das für die Proteinmarkierung verwendet wird, zu entfernen, da es einen unerwünschten Hintergrund auf der Deckglasoberfläche erzeugen kann. Es ist auch wichtig, eine Nukleasekontamination zu vermeiden, da diese das DNA-Substrat abbauen kann. Nach einem Experiment kann das Färben der verbleibenden DNA mit SYTOX-Orange eine gute Möglichkeit sein, um zu überprüfen, ob die DNA signifikant abgebaut wurde oder nicht. Ein gewisses Maß an DNA-Schäden ist im Laufe eines Experiments unvermeidlich, aber signifikante Schäden deuten oft auf eine problematische Nukleasekontamination hin.
Der Assay ist auch von Natur aus durch die Auflösung von beugungsbegrenzten Spots begrenzt, so dass fluoreszierende Proteine Hunderte von Basenpaaren (wenn nicht mehr) entfernt sein müssen, um sie als getrennt zu unterscheiden. Dies schränkt die Details ein, in denen CMG-Progression und Wechselwirkungen beobachtet werden können.
Die Anzahl der Abwicklungsereignisse, die wir bei jeder Analyse beobachten, variiert. Für ein erfolgreiches Experiment erwarten wir mindestens mehrere RPA-Strecken mit ausreichender Länge pro Sichtfeld von 512 x 512 Pixeln (Pixelgröße = 154,6 nm). Mehrere Sichtfelder können im selben Experiment abgebildet werden, was bei Bedarf eine weitere Datenerfassung ermöglicht. Die Trakte müssen nicht gleich lang sein oder das Ende der DNA erreichen, um nützlich zu sein. Zum Beispiel kann der durchschnittliche Tether-Abstand für jedes Experiment bestimmt werden, indem die Länge der SYTOX-gefärbten DNA vor der Zugabe von CMG gemessen wird. Dies kann verwendet werden, um abzuschätzen, wie viel DNA für einen RPA-Trakt abgewickelt wurde (solange genügend DNA abgewickelt ist, um die Gabel sichtbar zu bewegen), indem die Entfernung von “μm zurückgelegt” in “kb abgewickelt” umgerechnet wird.
CMG zeigt eine Abwickelaktivität auf einer Vielzahl von DNA-Substraten, aber es ist wichtig, ein freies 3′-DNA-Ende auf einem PolyT-Lappen von mindestens 30 nt bereitzustellen, um den Fußabdruck von CMG10 aufzunehmen. Der Einbau mehrerer Biotin-Anteile an der Gabel sorgt für eine robuste Oberflächenanbindung. Der Rest des DNA-Substrats kann auf vielfältige Weise neu gestaltet werden, z. B. um verschiedene DNA-Sequenzen, Längen und chemische Modifikationen einzubeziehen. Die Konformation der DNA kann durch die Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen von Magnesiumacetat verändert werden. Bei höheren Konzentrationen (≥10 mM) von Magnesiumacetat wird das RPA-beschichtete ssDNA-Filament verdichtet, was dazu führt, dass die DNA beim Abwickeln durch RPA-Bindung gezogen wird. Dies kann nützlich sein, da es verhindert, dass sich die DNA übermäßig bewegt, so dass die Position des CMG und des Abwickelverlaufs genauer gemessen werden kann. Bei niedrigen Konzentrationen (~3 mM) von Magnesiumacetat bleibt die RPA-ssDNA durchgehend entspannt.
Der beschriebene Einzelmolekül-Assay stellt eine Plattform dar, auf der aufgebaut und modifiziert werden kann, um weitere Aspekte der DNA-Replikation zu untersuchen. Während der DNA-Replikation fungiert CMG als Kern, um den sich das Replisom und seine Komponenten zusammensetzen. Daher können diesem Assay zusätzliche gereinigte Proteine hinzugefügt werden, einschließlich akzessorischer Faktoren wie TIMELESS, TIPIN und CLASPIN, um deren Wirkung auf die CMG-Dynamik zu untersuchen. Es wurde gezeigt, dass diese Proteine die Rate der Replikationsgabelnbeeinflussen 13, aber es ist nicht klar, wie sie die Rate der CMG-Abwicklung beeinflussen. Daher wäre es interessant zu untersuchen, wie sich verschiedene Replisomenproteine mit diesem Assay auf CMG auswirken. Die Zugabe von DNA-Polymerasen kann einen besseren Einblick in die DNA-Replikation geben, die über die alleinige DNA-Abwicklung hinausgeht, wie zuvor mit Hefeproteinen beschrieben14. Darüber hinaus kann die Aufreinigung von modifiziertem CMG ein besseres Verständnis dafür liefern, wie sich bestimmte Mutationen oder posttranslationale Modifikationen auf die Helikaseaktivität auswirken15,16. Darüber hinaus kann das Design verschiedener DNA-Substrate die Untersuchung der DNA-Abwicklung durch CMG unter einer Vielzahl von Bedingungen ermöglichen, die den Replikationsstress nachahmen17. Zu diesen Modifikationen gehören DNA-Hindernisse9, 18, Quervernetzungen zwischen den Strängen19, 20, 21 und Diskontinuitäten in den DNA-Strängen22.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Gheorghe Chistol für die Bereitstellung des pGC261-Plasmids und der Francis Crick Institute Chemical Biology Facility für die Peptidsynthese und -markierung. Diese Arbeit wurde vom Francis Crick Institute finanziert, das eine Grundfinanzierung von Cancer Research UK, dem UK Medical Research Council und dem Wellcome Trust (CC2133) erhält.
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
Acrylamide / Bis Solution 40% | BioRad | 1610148 | |
Agarose UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Used to prepare Tris Buffer (pH 8) |
ÄKTA Pure | GE Healthcare | – | Used with Fraction Collector F9-C; protein purification system |
ANTI-FLAG M2 affinity gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
APS 10% | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
ATP (200 mM) | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
ATP-g-s (100 mM) | Sigma-Aldrich | 11162306001 | |
Biotin-PEG coverslip | N/A | N/A | Prepared as described: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033 |
Biotinylated anti-digoxigenin antibody | Perkin Elmer | N/A | |
Blu Tack | Bostik | N/A | Adhesive putty |
Boric acid | Thermo Fisher Scientific | B/3800/53 | |
BSA; 33 mg/mL | SIGMA-ALDRICH | A3858-10G | Diluted from the stock |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
CaptoHiRes Q (5/50) | Cytiva | 29275878 | Connected to the AKTA protein purification system; high-resolution ion exchange chromatography column |
Casein (5% in water, 50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | C4765-10ML | |
ChemiDoc system | Bio-Rad | N/A | |
Clips | N/A | N/A | |
Cutting board | N/A | N/A | |
Dialysis tubing (3.5 kDa) | Fisher Scientific | 11425859 | |
digoxigenin-11-dUTP | Roche | 11209256910 | |
DNA loading dye 6x | NEB | B7024S | |
dNTP 10 mM | NEB | N0447S | |
Double-sided tape (0.14 mm thick) | N/A | N/A | |
DTT | Fluorochem Limited | M02712-10G | |
DYKDDDDK peptide | N/A | N/A | Synthetised by chemical biology STP of The Francis Crick Institute |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | D/0700/68 | |
EGFP-RPA | N/A | N/A | Purified as desribed in ‘Single Molecule Analysis’, Series Methods in Molecular Biology, Vol. 783 (2011), Peterman, E. J. G. and Wuite G. J. L. editors, Humana Press. Protein information: 2 mM, human, expressed in E. coli. |
EGTA | Sigma-Aldrich | 03779-10G | |
Epoxy – 5 minute | Devcon | 20845 | |
Fujifilm FLA-5000 | Fujifilm | FLA-5000 | Fluorescent image analyzer |
GelRed Nucleic Acid Stain; 10000x | Cambridge Bioscience | 41003-BT | Example of nucleic acid stain which is a safer alternative to ethidium bromide. |
Glass or quartz slide with holes for tubing | Dremel Model 395 | 1 mm thick slide, cut to 2.4 cm x 1cm, two holes drilled 1.4 mm apart. The holes should be drilled to different sizes to accommodate different tubing at each end. | |
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650/17 | |
Glycine HCl, pH 3.5 | Sigma-Aldrich | G8898 | |
Hamilton syringe, 1000 series GASTIGHT, PTFE luer lock 1010TLL, PTFE Luer lock (with slots), volume 10 mL | Merck | 26211-U | |
HEPES pH 7.5 | Sigma-Aldrich | H4034 | |
I-CeuI | NEB | R0699L | |
KCl | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
Magnesium acetate | Sigma-Aldrich | M2545 | |
Maxi GeBaFlex-tube Dialysis Kit; MWCO 14 kDa | Generon | D055 | |
Metal spatula | N/A | N/A | |
Metal tweezers | N/A | N/A | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Millex-GP (Syringe filters) 0.22 µm | Merck | SLGP033RS | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Needle | N/A | N/A | |
NotI-HF | NEB | R3189L | |
NuPAGE 4%–12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | 10247002; | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific | NP0001 | |
Objective heater | Okolab | N/A | |
PCR mix – 2x | Prepared from Phusion DNA polymerase (20 µL), 10 mM dNTPs (40 µL), 5x Phusion HF buffer (400 µL) and water (540 µL). | ||
Peptide NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, labelled with LD655-MAL | N/A | N/A | peptide NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, labeled with LD655-MAL (Lumidyne Technologies) on the cysteine residue, was synthetised and purified by the peptide chemistry STP of The Francis Crick Institute |
pGC261 plasmid | N/A | N/A | https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
Plastic tweezers | N/A | N/A | |
Polyethylene tubing PE20 (inner diameter 0.015”, outer diameter 0.043”) | Becton Dickinson | 427406 | |
Polyethylene tubing PE60 (inner diameter 0.03”, outer diameter 0.048”) | Becton Dickinson | 427416 | |
Poly-Prep Chromatography Columns; 10 ml and 20 ml | Bio-Rad | 7311550 | |
Potassium Glutamate (L-glutamic acid potassium salt monohydrate) | Sigma | G1501-1KG | |
Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA free) | Roche | 5056489001 | |
Pump 11 Elite Infusion/Withdrawal Programmable Single Syringe | Harvard Apparatus | 70-4504 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Razor blade | VWR International Ltd | 233-0156 | |
rCutSmart Buffer; 10x | NEB | B6004S | |
Sodium acetate | Thermo Fisher Scientific | S/2120/53 | |
Sortase (pentamutant) | N/A | N/A | Purified based on: https://doi.org/10.1073/pnas.1101046108 |
Spin-X Centrifuge Tube Filters; 0.22 µm cellulose acetate | Fisher Scientific | 10310361 | |
Sterile scalpel | N/A | N/A | |
Steritop Vacuum Driven Disposable Filtration System; 0.22 um; PES; | Millipore | S2GPT05RE | |
Streptavidin (1 mg/mL) in 1x PBS buffer | Sigma | S4762-10MG | 20 µL aliquotes |
SYBR Gold | Thermo Fisher Scientific | S11494 | Highly sensitive nucleic acid stain we used to visualise DNA fork substrate. |
SYTOX orange; 5 µM in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
T4 DNA ligase | NEB | M0202M | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
TEV protease (1 mg/mL); EZCut | Biovision | 7847-10000 | |
Tissue grinders, Dounce type (40 mL, Wheaton) | DWK Life Sciences | 432-1273 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | Used to prepare Tris Buffer (pH 8) |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tween-20 | Promega UK Ltd | H5152 |