In diesem Artikel wird ein standardisiertes Verfahren zur kontrollierten, reversiblen Malperfusion viszeraler Organe in Rattenmodellen vorgestellt. Ziel ist es, diese Malperfusionszustände mit einem hohen Maß an methodischer Sicherheit und Kontrolle zu induzieren und gleichzeitig die technische Einfachheit und Fehlerresilienz zu wahren.
Neben Sepsis und Malignität ist die Malperfusion die dritthäufigste Ursache für den Gewebeabbau und ein wichtiger Pathomechanismus für verschiedene medizinische und chirurgische Erkrankungen. Trotz bedeutender Entwicklungen wie Bypass-Operationen, endovaskuläre Verfahren, extrakorporale Membranoxygenierung und künstliche Blutersatzstoffe bleibt die Malperfusion des Gewebes, insbesondere der viszeralen Organe, ein drängendes Problem in der Patientenversorgung. Der Bedarf an weiterer Forschung zu biomedizinischen Prozessen und möglichen Eingriffen ist hoch. Valide biologische Modelle sind von größter Bedeutung, um diese Art von Forschung zu ermöglichen. Aufgrund der multifaktoriellen Aspekte der Gewebeperfusionsforschung, die nicht nur die Zellbiologie, sondern auch die vaskuläre Mikroanatomie und Rheologie umfassen, erfordert ein geeignetes Modell einen Grad an biologischer Komplexität, den nur ein Tiermodell bieten kann, so dass Nagetiere das offensichtliche Modell der Wahl sind. Die Gewebemalperfusion kann in drei verschiedene Zustände unterschieden werden: (1) isolierte arterielle Ischämie, (2) isolierte venöse Stauung und (3) kombinierte Malperfusion. In diesem Artikel wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die kontrollierte und reversible Induktion dieser drei Arten von viszeraler Malperfusion mittels Mittellinien-Laparotomie und Abklemmen der Bauchaorta und der Kavalvene bei Ratten vorgestellt und die Bedeutung einer präzisen Operationsmethodik unterstrichen, um einheitliche und zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten. Paradebeispiele für mögliche Anwendungen dieses Modells sind die Entwicklung und Validierung innovativer intraoperativer Bildgebungsmodalitäten wie Hyperspectral Imaging (HSI) zur objektiven Visualisierung und Differenzierung von Malperfusionen von gastrointestinalen, gynäkologischen und urologischen Organen.
Während die Auswirkungen von Gewebeperfusionsentzug in Form von lokalen oder systemischen Gewebemalperfusionszuständen seit langem anerkannt sind, sind sie nach wie vor eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität sowohl in den Vereinigten Staaten als auch in Europa1. Diese Malperfusionszustände sind nach Malignität und septischen Entzündungen die dritthäufigste Ursache für den Gewebeabbau, haben aber im Vergleich zu den beiden letztgenannten ein weitaus breiteres Ursprungsspektrum2.
Dieses Spektrum reicht von lokalen Mechanismen wie Vorhofflimmern mit thromboembolischem Verschluss, Vasokonstriktion und iatrogener oder traumatischer Dissektion bis hin zu systemischen Mechanismen wie Herzinsuffizienz oder -schock, Sepsis, Hypovolämie und Steal-Phänomenen. Diese vielfältigen Mechanismen liegen einer Vielzahl von medizinischen und chirurgischen Erkrankungen zugrunde. Die signifikante Morbidität und Mortalität, die mit diesen Erkrankungen verbunden ist, hat die medizinische Aufmerksamkeit im Laufe der Jahrzehnte auf Verfahren zur Wiederherstellung des Blutflusses in malperfundiertem Gewebe gelenkt, um Nekrosen vorzubeugen und die Organfunktion wiederherzustellen3.
Diese Forschungsanstrengungen haben zu einer Vielzahl von pharmazeutischen, medizinischen und chirurgischen Lösungen zur Wiederherstellung der physiologischen Organperfusion geführt, darunter Fortschritte in der Bypass-Chirurgie4, endovaskulären Verfahren5, der extrakorporalen Membranoxygenierung 6,7, der Perfusion von Organmaschinen während der Transplantation8 und künstlichen Blutersatzstoffen9.
Trotz dieser bedeutenden Entwicklungen bleibt die Malperfusion, insbesondere der viszeralen Organe, ein drängendes Problem in der Patientenversorgung, und der Bedarf an weiterer Forschung zu biomedizinischen Prozessen und Rettungsstrategien ist hoch. Valide biologische Modelle sind von größter Bedeutung, um diese Art von Forschung zu ermöglichen. Aufgrund der multifaktoriellen Aspekte der Gewebeperfusionsforschung, die nicht nur die Zellbiologie, sondern auch die vaskuläre Mikroanatomie und Rheologie umfassen, erfordert ein geeignetes Modell einen Grad an biologischer Komplexität, den nur ein vollständiger Modellorganismus bieten kann, so dass Nagetiere das offensichtliche Modell der Wahl sind.
Die Gewebemalperfusion kann in drei verschiedene Zustände unterschieden werden: isolierte arterielle Ischämie, isolierte venöse Stauung und kombinierte Malperfusion10. Klinisch relevante Szenarien für diese Erkrankungen sind (1) Arterielle Ischämie: Vorhofflimmern mit thromboembolischem Verschluss, septische Embolien, Vasokonstriktion, iatrogene oder traumatische Gefäßdissektion oder -klemmung, Herzinsuffizienz oder -schock, Aortendissektion, Sepsis und Hypovolämie, extreme arterielle Obstruktion aufgrund einer äußeren Verengung, Lungenarterienembolie, chronische arterielle Gefäßverschlusserkrankungen oder Steal-Phänomene; (2) Venöse Stauung: iatrogene oder traumatische Gefäßdissektion oder -klemmung, Herzinsuffizienz, Leberfibrose oder Leberzirrhose, Venenobstruktion aufgrund äußerer Verengung, Venenthrombose, Veneninsuffizienz und Budd-Chiari-Syndrom; (3) Kombinierte Malperfusion: Kombinationen der oben genannten Zustände und fortgeschrittene Stadien der oben genannten Erkrankungen, wie z. B. sekundäre venöse Stauung aufgrund einer ischämieinduzierten Fibrose oder sekundäre arterielle Ischämie aufgrund einer stauungsinduzierten Retention, sowie spezifische Organerkrankungen wie ischämische Entzündungen (z. B. ischämische Kolitis)11,12.
Dieser Artikel zielt daher darauf ab, ein Schritt-für-Schritt-Modell zur Induktion einer kontrollierten, reversiblen viszeralen arteriellen Ischämie, einer venösen Stauung und einer kombinierten Malperfusion über Mittellinien-Laparotomie bei Ratten sowohl für Überlebens- als auch für Nicht-Überlebensanwendungen bereitzustellen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Das experimentelle Modell bietet eine kontrollierte Umgebung für die Untersuchung der vielschichtigen Dynamik von arterieller Ischämie, venöser Stauung und ihren kombinierten Folgeerscheinungen und emuliert klinisch relevante Szenarien, die unter verschiedenen Bedingungen auftreten.
Abbildung 1: Überblick über das Protokoll. Schematische Darstellung der vaskulären Anatomie der Ratte und Darstellung der Klemmstelle (grauer Pfeil). (A) Physiologische Durchblutung. (B) Arterielle Ischämie. (C) venöse Stauung. (D) Kombinierte Malperfusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Während die periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) allein als prominentester Vertreter von Gewebemalperfusionserkrankungen bereits eine Prävalenz von etwa 7 % aufweist und allein in den Vereinigten Staaten schätzungsweise 8,5 Millionen Erwachsene betrifft18, ist die Gewebemalperfusion im Allgemeinen ein relevanter Pathomechanismus bei den meisten chirurgischen und medizinischen Erkrankungen. Folglich sind geeignete und reproduzierbare Tiermodelle zwingend erforderlich, um neuartige Forschungsfragen in diesem Bereich zu adressieren.
Die drei vaskulären dynamischen Situationen, die einer differenzierten Untersuchung bedürfen, sind die arterielle Ischämie, die venöse Stauung und die kombinierte Malperfusion. Durch die Induktion einer isolierten arteriellen Ischämie können die Wissenschaftler das zeitliche und räumliche Fortschreiten der Gewebehypoxie genau beschreiben und die molekularen Kaskaden untersuchen, die an Ischämie-Reperfusionsschäden, zellulärer Apoptose und Entzündungsreaktionen beteiligt sind. Durch die Kompromittierung der venösen Drainage, einer oft übersehenen Facette der Gefäßpathologie, können Wissenschaftler das Zusammenspiel zwischen arteriellen Zuflüssen und venösen Abflussdiskrepanzen untersuchen und Licht auf die Pathophysiologie von Venenthrombosen, stauungsbedingten Gewebeödemen und mikrozirkulatorischen Dysfunktionen werfen. Wenn man diese beiden pathologischen Situationen kombiniert, kann man das dyssynergistische Milieu der kombinierten Malperfusion untersuchen, was die komplexe Pathophysiologie widerspiegelt, die bei klinischen Syndromen wie der akuten mesenterialen Ischämie und der ischämischen Kolitis auftritt.
Neben der Aufklärung grundlegender pathophysiologischer Mechanismen dient die Fähigkeit, viszerale arterielle Ischämie, venöse Stauung und kombinierte Malperfusion bei Ratten zu induzieren, als unverzichtbare Plattform für die Bewertung der Wirksamkeit pharmakologischer Interventionen, chirurgischer Techniken, neuer therapeutischer Strategien und innovativer Bildgebungsverfahren, insbesondere wie HSI 14,19,20,21,22. Dieses Modell ist daher eine Schlüsselkomponente bei der Bereitstellung der erforderlichen biologischen Ground Truth, die erforderlich ist, um das volle Potenzial von HSI bei der Gewebebewertung und Identifizierung von Perfusionszuständen auszuschöpfen. Durch die Nutzung dieses Versuchsaufbaus können Forscher die Umsetzung präklinischer Befunde in klinisch tragfähige Strategien beschleunigen und letztendlich die Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit verschiedenen Gefäß- und Perfusionserkrankungen reduzieren.
Zur Veranschaulichung können Forscher dieses Modell verwenden, um die Wirksamkeit pharmakologischer Wirkstoffe zu untersuchen, die auf Ischämie-Reperfusions-Verletzungswege abzielen, wie z. B. Antioxidantien, entzündungshemmende Wirkstoffe und Vasodilatatoren, und so ihren potenziellen Nutzen in der klinischen Praxis abzugrenzen23,24. Darüber hinaus erleichtert dieses Modell die Bewertung neuartiger chirurgischer Ansätze, wie z. B. mesenteriale Revaskularisationstechniken und venöse dekompressive Verfahren, und bietet unschätzbare Einblicke in deren Machbarkeit, Sicherheit und langfristige Wirksamkeit25,26.
Darüber hinaus ermöglicht dieser experimentelle Rahmen den Forschern, das komplizierte Zusammenspiel zwischen vaskulärer Dysfunktion und systemischen Komorbiditäten wie Diabetes, Bluthochdruck und Atherosklerose zu untersuchen und so das komplizierte Geflecht miteinander verbundener pathophysiologischer Signalwege zu veranschaulichen, die das Fortschreiten der Gefäßerkrankung orchestrieren27,28.
Während es mehrere Veröffentlichungen zur selektiven Malperfusion einzelner Organe, wie z.B. der Leber 29,30,31 oder der Niere, gibt, gibt es bei Ratten 32,33 einen Mangel an wissenschaftlicher Literatur, die sich mit der Malperfusion der gesamten Eingeweide bei Ratten befasst, und es gibt explizit kein methodisches Protokoll. Dies ist also die Behauptung dieses Manuskripts. Zu den Einschränkungen der vorgestellten Technik gehören vor allem die Invasivität des Verfahrens und, abhängig von der Dauer der Malperfusion, konsekutive Organthrombosen und Funktionsstörungen, die möglicherweise zu postoperativem Leiden durch Multiorganversagen oder abdominales Kompartmentsyndrom führen 34,35,36. Eine sorgfältige Planung und Konzeption, je nach Fragestellung, kann helfen, die erforderliche Dauer der Malperfusion und ihre pathophysiologischen Folgen auszugleichen.
Bei der Fehlerbehebung bei häufigen Herausforderungen, die während des Eingriffs auftreten, sollte auf die folgenden Punkte und Empfehlungen geachtet werden: (1) Stellen Sie sicher, dass die Ausrüstung und die Medikamente im Voraus gründlich vorbereitet sind, um Unterbrechungen während des Eingriffs zu minimieren. (2) Führen Sie die hämostatische Kontrolle sorgfältig durch, indem Sie die avaskulären Ebenen sorgfältig vorbereiten und dissektionieren. Erwägen Sie die Verwendung einer bipolaren hämostatischen Pinzette für die elektrische Blutstillung, falls verfügbar. (3) Minimieren Sie das Trauma des Gewebes durch die Verwendung von nicht-traumatischen Instrumenten wie befeuchteten Wattestäbchen oder befeuchteten chirurgischen Kompressen mit Pinzette, wenn Sie mit dem Leberparenchym in Kontakt kommen; (4) Bei etwa 20 % der Tiere kam es aufgrund empfindlicher Gewebebedingungen zu diffusen oberflächlichen Leberparenchymblutungen. Die Blutung stoppte jedoch in allen Fällen mit leichter Kompression und Geduld. Diese Empfehlungen zielen darauf ab, die Verfahrenseffizienz zu verbessern und Komplikationen bei der Induktion von Malperfusion in Rattenmodellen zu minimieren.
Bei der Resektion des Xiphoids für einen besseren Zugang zur Vena cavalis ist darauf zu achten, dass das Peritoneum dorsal zum Übergang zwischen Xiphoid und Brustbein über einige Millimeter intakt bleibt. Die Resektionsstelle des Xiphoids ist hart und scharf, was möglicherweise zu einem Trauma des oberflächlichen Leberparenchyms führt. Daher wird empfohlen, das retrosternale Peritoneum kaudal mit einer Pinzette zu mobilisieren und effektiv um den Knochenstumpf zu wickeln, ihn zu bedecken und die Blutstillung zu unterstützen. Die chirurgischen Präparationshaken sollten mit kranialer Spannung durch die kraniale ventrale Bauchdecke genäht werden, so dass die peritoneale Abdeckung des Xiphoidstumpfes an Ort und Stelle bleibt.
Bei der Präparation des Bandes falciformis sollte darauf geachtet werden, dass es nicht versehentlich zu iatrogenen Verletzungen der Lebervene kommt, da dies für das Tier tödlich sein kann. Aufgrund des hohen Blutungsrisikos während der Gefäßpräparation wird empfohlen, den Großteil der chirurgischen Präparation durch Spreizen mit stumpfen Überholtklammern und nicht durch Verwendung scharfer Dissektionsinstrumente durchzuführen. Darüber hinaus sollten Silikongefäßschlaufen vor der Verwendung angefeuchtet werden, um die Oberflächenreibung zu verringern und das Risiko eines Gewebetraumas zu minimieren.
Bei der Anwendung der Aneurysma-Mikrovaskulärklemme ist es entscheidend, die genaue Gefäßanatomie zu visualisieren. So entspringt die Arteria coeliacus sehr kranial aus der Bauchschlagader. Wenn ein Zöliakie-Verschluss gewünscht ist, z. B. zur Untersuchung einer hepatischen Malperfusion, sollte die Zöliakie-Arterie in Bezug auf die Aorta und die Silikongefäßschlinge sichtbar gemacht werden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Arteria coeliacus in das eingeklemmte Gefäßgewebe einbezogen wird (Abbildung 2V-Z). Es gab einen Fall, in dem die Klemme versehentlich zunächst kaudal zur Zöliakiearterie platziert wurde. Dies wurde jedoch aufgrund des fehlenden Abfalls der StO2-Leberwerte sofort erkannt, und es wurde erfolgreich eine ordnungsgemäße Reclamp durchgeführt.
Der gefährlichste Präparationsschritt ist das Tunneln der Vena cavale. Dieser Schritt erfordert sanfte Bewegungen und Geduld, und Overholt-Klemmen sollten nur dann gespreizt werden, wenn sicher ist, dass kein Kontakt mit der Kavalvene besteht. Es kann schwierig sein, dies zu beurteilen, da die Vena cavale bei leichter Kompression als dünnes avaskuläres Bindegewebe erscheint, wodurch das eingeschlossene Blut in beide Richtungen verschwindet. Es besteht auch die Gefahr einer versehentlichen Pleuraöffnung und der Entstehung eines Pneumothorax, wenn die Kavalvene zu kranial tunnelt wird. Dies kann eine schwerwiegende und lebensbedrohliche Komplikation sein, zumal das Tier spontan atmet und keine invasiven Beatmungsmaßnahmen ergriffen werden können. Es hat sich als hilfreich erwiesen, die Präparationsinstrumente leicht zurückzuziehen und kaudaler fortzufahren, um diese Komplikation zu vermeiden. Bei hämodynamisch relevanten und sichtbaren Pneumothorax mit Vorwölbung des Leberzwerchfells kann als Rettungsstrategie eine transdiaphragmatische Einmalpunktion und Aspiration der eingeschlossenen Luft mit einer 30 G Nadel und einer kleinen Spritze empfohlen werden. Diese Technik wurde erfolgreich bei einem Tier eingesetzt, um es intraoperativ zu retten.
Schließlich ist beim Anlegen der mikrovaskulären Klemmen besonders darauf zu achten, dass umliegendes Bindegewebe nicht einbezogen wird, was zu einem unzureichenden Verschluss des gewünschten Gefäßes führen könnte.
Während dieses Protokoll als Schritt-für-Schritt-Anleitung für die globale viszerale Malperfusion gedacht ist, kann die Klemmstelle aufgrund der in Abbildung 1T-V dargestellten umfangreichen Gefäßvorbereitung und Mobilisierung entsprechend der spezifischen Forschungsfrage angepasst werden. Daher bietet sich auch bei der Wahl der Klemmstelle weiter distal entlang des Gefäßbaums eine gezielte Malperfusion von Organgruppen oder einzelnen Organen an, wie z.B. das selektive Einklemmen des Truncus coeliacus bei hepatischer Ischämie. Durch das Angebot einer detaillierten und reproduzierbaren Methodik ermöglicht dieses Protokoll einen standardisierten Ansatz für kontrollierte reversible arterielle Ischämie, venöse Stauung und kombinierte Malperfusion in Rattenmodellen, was zu einer verbesserten Datenzuverlässigkeit, Robustheit, Unabhängigkeit der Forscher und Vergleichbarkeit in zukünftigen Tierversuchen führt. Damit stellt es ein unverzichtbares Werkzeug im Arsenal der biomedizinischen Forschung dar und bietet Einblicke in das komplexe Zusammenspiel von Gefäßkompromittierung, Gewebeverletzung und therapeutischen Eingriffen. Durch die Nutzung der Vielseitigkeit dieses Versuchsaufbaus können Forscher die Geheimnisse rund um die vaskuläre Pathophysiologie erforschen, neue Grenzen in der translationalen Medizin erschließen und letztendlich die Patientenergebnisse im Bereich der Gefäßgesundheit verbessern.
The authors have nothing to disclose.
Die Autorinnen und Autoren danken dem Datenspeicherungsdienst, der vom Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst Baden-Württemberg (MWK) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) durch die Zuwendungen INST 35/1314-1 FUGG und INST 35/1503-1 FUGG unterstützt SDS@hd. Darüber hinaus bedanken sich die Autoren für die Unterstützung durch das NCT (Nationales Centrum für Tumorerkrankungen in Heidelberg, Deutschland) durch sein strukturiertes Postdoc-Programm und das Programm Chirurgische Onkologie. Wir würdigen auch die vom Landtag Baden-Württemberg bewilligte Unterstützung aus Landesmitteln für den Innovationscampus Health + Life Science Allianz Heidelberg Mannheim aus dem strukturierten Postdoc-Programm für Alexander Studier-Fischer: Artificial Intelligence in Health (AIH) – Eine Kooperation von DKFZ, EMBL, Universität Heidelberg, Universitätsklinikum Heidelberg, Universitätsklinikum Mannheim, Zentralinstitut für Seelische Gesundheit, und das Max-Planck-Institut für medizinische Forschung. Des Weiteren bedanken wir uns für die Unterstützung durch das DKFZ Hector Krebsinstitut am Universitätsklinikum Mannheim. Für die Publikationsgebühr danken wir der Deutschen Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Förderprogramms “Open Access Publikationskosten” sowie der Universität Heidelberg für eine finanzielle Unterstützung.
Atraumatic preparation forceps | Aesculap | FB395R | DE BAKEY ATRAUMATA atraumatic forceps, straight |
Blunt overholt clamp | Aesculap | BJ012R | BABY-MIXTER preparation and ligature clamp, bent, 180 mm |
Cannula | BD (Beckton, Dickinson) | 301300 | BD Microlance 3 cannula 20 G |
Fixation rods | legefirm | 500343896 | tuning forks used as y-shaped metal fixation rods |
Heating pad | Royal Gardineer | IP67 | Royal Gardineer Heating Pad Size S, 20 Watt |
Plastic perfusor tube | M. Schilling GmbH | S702NC150 | connecting tube COEX 150 cm |
Preparation scissors | Aesculap | BC177R | JAMESON preparation scissors, bent, fine model, blunt/blunt, 150 mm (6") |
Silicone vessel loop tie | SERAG WIESSNER | SL26 | silicone vessel loop tie 2,5 mm red |
Spraque Dawley rat | Janvier Labs | RN-SD-M | Spraque Dawley rat |
Steel plate | Maschinenbau Feld GmbH | C010206 | Galvanized sheet plate, 40 x 50 cm, thickness 4.0 mm |
Yasargil clip | Aesculap | FE795K | YASARGIL Aneurysm Clip System Phynox Temporary (Standard) Clip |
Yasargil clip applicator | Aesculap | FE558K | YASARGIL Aneurysm Clip Applicator Phynox (Standard) |
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