Transformation mitochondriale chez Baker

La levure Saccharomyces cerevisiae est un modèle largement reconnu utilisé pour étudier la biogenèse mitochondriale. Comme la levure est un organisme anaérobie et facultatif, il est possible d’étudier de manière approfondie les causes et les conséquences de l’introduction de mutations qui altèrent la respiration. De plus, cet organisme possède des outils génétiques et biochimiques amicaux pour étudier les voies mitochondriales. Cependant, l’une des ressources les plus puissantes pour explorer les mécanismes de l’assemblage des complexes respiratoires et de la synthèse des protéines mitochondriales est la capacité de transformer les mitochondries et de modifier le génome de l’organite. Auparavant, il a été utile d’introduire dans l’ADN mitochondrial (ADNmt) des mutations ponctuelles ou de petites délétions / insertions ^1,2,3,4,5, de supprimer les gènes ^6,7, de faire des réarrangements de gènes ^7,8, d’ajouter des épitopes aux protéines mitochondriales ^9,10, de déplacer des gènes du noyau vers les mitochondries¹¹,¹², et introduire des gènes rapporteurs comme BarStar¹³, GFP^14,15, luciférase¹⁶ et le plus largement utilisé ARG8^{m 17,18}. Les modifications du génome mitochondrial nous ont permis de disséquer et d’identifier des mécanismes qui auraient autrement été difficiles à comprendre. Par exemple, le gène rapporteur ^{ARG8 m} inséré au locus COX1 dans l’ADN mitochondrial a été crucial pour comprendre que Mss51 a un double rôle dans la biogenèse de Cox1. Premièrement, il s’agit d’un activateur translationnel de l’ARNm COX1, et deuxièmement, il s’agit d’un chaperon d’assemblage de^{la protéine} Cox1 ^7,19 nouvellement fabriquée. Ce travail présente une méthode détaillée pour transformer les mitochondries de S. cerevisiae. Bien que le protocole de transformation mitochondriale ait été publié plus tôt 16,20,21,22,23, une approche visuelle à travers une vidéo est essentielle pour bien comprendre les différentes étapes et les détails de la méthode. La méthode se compose de plusieurs étapes et se divise en quatre grandes étapes :

Figure 1 : Vue d’ensemble de la procédure de transformation mitochondriale par bombardement de microprojectiles à grande vitesse : 1) Les particules de tungstène sont stérilisées et préparées avant le revêtement de l’ADN. 2) Deux plasmides différents sont précipités à la surface des WP. L’un est un plasmide bactérien contenant la construction qui sera dirigée vers la matrice mitochondriale. L’autre est un vecteur d’expression de levure nucléaire porteur d’un marqueur d’auxotrophie. 3) Une souche de levure réceptrice dépourvue d’ADN mitochondrial (rho⁰) est cultivée sur une source de carbone fermentative comme le galactose ou le raffinose, qui n’exerce aucune répression du glucose de l’expression des gènes mitochondriaux^34,35. La culture est étalée sur des boîtes de Pétri contenant le milieu de bombardement. 4) Les WP recouverts de plasmides sont projetés vers la souche réceptrice par bombardement de microprojectiles à grande vitesse. 5) Les ^rho-colonies synthétiques positives contenant le plasmide mitochondrial sont sélectionnées par accouplement à une souche testeuse. 6) La construction mitochondriale est intégrée dans le génome mitochondrial au locus souhaité en accouplant la souche synthétique rho^– (donneur) avec la souche accepteuse par un processus connu sous le nom de cytoduction. 7) Le récepteur positif, souche haploïde porteuse de la construction mitochondriale, est sélectionné et purifié dans différents milieux. Abréviations : WPs = particules de tungstène ; ADNmt = ADN mitochondrial. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Transformation des cellules avec la construction de l’ADN destinée à s’intégrer dans le génome mitochondrial (Figure 1, étapes 1-4)
Bien qu’il soit possible de transformer directement une levure contenant un génome mitochondrial complet (rho⁺), la transformation est 10 à 20 fois plus efficace si les cellules sont dépourvues d’ADN mitochondrial (rho⁰)²⁴. Les particules de tungstène (WP) sont recouvertes de deux plasmides différents qui seront co-transformés. Le premier est un vecteur d’expression de levure 2 μ portant un marqueur d’auxotrophie, tel que LEU2 ou URA3 (par exemple, YEp351 ou YEp352, respectivement). Si l’introduction biolistique de l’ADN dans les cellules de levure réussit, les transformants se développeront sur le milieu d’auxotrophie (c’est-à-dire un milieu dépourvu de leucine ou d’uracile). Ce plasmide est utile pour faire la première sélection des cellules qui ont acquis le plasmide nucléaire ; Sinon, le nombre de colonies résultantes saturerait la plaque. Le deuxième plasmide est un plasmide bactérien (tel que pBluescript ou similaire) contenant la construction mitochondriale destinée à être intégrée dans le génome mitochondrial. La construction doit contenir au moins 100 nt de séquences mitochondriales flanquantes 5′ et 3′ pour la recombinaison avec la région mitochondriale d’intérêt. D’après notre expérience, les séquences flanquantes plus grandes sont plus susceptibles de se recombiner avec succès avec le locus cible dans le génome mitochondrial.

La figure 2²⁵ en montre un exemple précis. Dans cet exemple, l’objectif était de supprimer la région du gène mitochondrial COX1 codant pour les 15 derniers acides aminés de la protéine correspondante (Cox1ΔC15) (Figure 2A). Le plasmide bactérien porteur de la mutation COX1ΔC15 contenait respectivement 395 nt et 990 nt des régions 5′ et 3′ non traduites du gène. Le plasmide a été dérivé de pBluescript (pXPM61) et, avec le plasmide à 2 μ YEp352, ils ont été coprécipités à la surface des WP (Figure 2B). Les WP ont ensuite été introduits par bombardement de microprojectiles dans la souche réceptrice sélectionnée (figure 2C). Cette souche, nommée NAB69²⁶, est une souche MATa, rho⁰ portant les allèles kar1-1 et ade2 (l’importance de ces caractéristiques est discutée ci-dessous). Les cellules ont été plaquées sur un milieu de bombardement dépourvu d’uracile pour sélectionner celles qui ont acquis le plasmide de 2 μ (Figure 2C). Les cellules ont été cultivées pendant 5 à 7 nuits à 30 °C.

Sélection des cellules qui ont acquis le plasmide bactérien contenant la construction mitochondriale et le plasmide nucléaire 2 μ portant le marqueur de l’auxotrophie (Figure 1, étape 5)
Les colonies positives conserveront de nombreuses copies du plasmide bactérien dans leurs mitochondries^22. Étant donné que les cellules transformées sont à l’origine rho⁰, aucune séquence mitochondriale ne soutient la traduction de la construction mitochondriale présente dans le plasmide ; Par conséquent, le gène mitochondrial transformé ne sera pas exprimé. Il est nécessaire d’accoupler les transformants avec une souche testeuse pour détecter les colonies de levures qui ont acquis le plasmide mitochondrial. Le génome mitochondrial de la souche testeuse contient une version mutée non fonctionnelle du gène d’intérêt. Après l’accouplement, les mitochondries fusionneront et la séquence mitochondriale incluse dans le plasmide transformé se recombinera avec le gène mitochondrial muté de la souche testeuse ; par conséquent, la récupération du gène WT reconstituera la fonction. Le diploïde résultant aura un phénotype positif détectable (généralement la capacité de se développer dans un milieu respiratoire ou un milieu dépourvu d’arginine). Les cellules positives portant le plasmide bactérien dans les mitochondries sont appelées « ^rhocellules synthétiques ». Dans l’exemple spécifique de la figure 2D, des ^rhocellules synthétiques portant la construction COX1ΔC15 (nommées XPM199) ont été répliquées sur un milieu dépourvu d’uracile (c’est la plaque maîtresse à partir de laquelle les colonies positives ont été purifiées). Ils ont également été répliqués sur une souche testrice L45²⁷ lawn, qui contient la mutation non fonctionnelle cox1D369N. Après s’être accouplés pendant deux nuits, le génome mitochondrial de L45 et XPM199 s’est recombiné, ce qui a donné lieu à un gène COX1 fonctionnel ; Par conséquent, les diploïdes ont récupéré la capacité de se développer sur les milieux respiratoires. Dans la plaque maîtresse, nous avons choisi les colonies positives. Ils ont été striés sur des plaques dépourvues d’uracile, et les tests sélectifs ont été répétés pour obtenir des ^rhocellules synthétiques pures (Figure 2E). Il est important de noter que la plaque d’essai ne sert qu’à l’identification des ^rhocolonies synthétiques, et que les mutants ne peuvent pas être récupérés à partir de ces plaques.

Intégration de la construction dans le génome mitochondrial de la souche visée
Cette étape est réalisée par un processus appelé cytoduction^28,29 (Figure 1, étape 6). Dans cette approche, la souche synthétique ^rho-strain (souche donneuse) est accouplée à la souche accepteuse prévue du type d’accouplement opposé. Une condition essentielle est qu’au moins l’une des deux souches d’accouplement soit porteuse de la mutation kar1-1 pour empêcher la fusion nucléaire³⁰. Par conséquent, l’accouplement des deux cellules produit un zygote binucléé (Figure 3). Le réseau mitochondrial des cellules parentales (donneur et accepteur) fusionne et les molécules d’ADN mitochondrial se recombinent. Les zygotes binucléés sont incubés/récupérés pour permettre le bourgeonnement, ce qui produira des cellules haploïdes. Ces haploïdes portent le fond nucléaire de l’une des cellules parentales. De même, les haploïdes peuvent porter l’ADN mitochondrial de la cellule parentale ou de l’ADN mitochondrial recombiné d’intérêt. Cependant, la mutation kar1-1 n’est pas efficace à 100%, et de vrais diploïdes se formeront pendant l’accouplement ^28,29. La souche synthétique rho^– (donneur, XPM199) portait l’allèle kar1-1 dans l’exemple. En tant que marqueur sélectif, il avait l’allèle ade2, ce qui en fait un auxotrophe de l’adénine (Figure 4). La souche accepteuse était XPM10, une souche rho⁺ portant la construction cox1Δ ::ARG8^m, où le rapporteur ARG8^m a remplacé les codons COX1 dans le génome mitochondrial⁷. Le mélange des deux cultures cellulaires a été ajouté à une plaque YPD sous forme de goutte pour permettre l’accouplement. Après 3 à 5 h, les cellules ont été observées au microscope optique pour détecter la formation de shmoos (Figure 3B), une forme de cellule associée à l’accouplement. Après le temps d’incubation/récupération, les zygotes binucléaires ont été plaqués sur un milieu dépourvu d’adénine pour empêcher la croissance des cellules donneuses.

Sélection de la souche haploïde porteuse du génome mitochondrial d’intérêt (Figure 1, étape 7)
Un mélange de cellules donneuses, acceptrices et diploïdes est présent après la cytoduction. Par conséquent, après l’incubation/récupération des zygotes binucléés, les cellules doivent être cultivées dans différents milieux sélectifs pour identifier et purifier les haploïdes d’intérêt. Le milieu sélectif dépend des génotypes du donneur, des souches accepteuses et de la construction mitochondriale prévue. Cependant, en général, le raisonnement derrière le choix du milieu sélectif est le suivant : i) après l’incubation/récupération, le mélange de cytoduction est cultivé sur un milieu sélectif où la souche parentale donneuse ne peut pas se développer. Dans l’exemple spécifique de la figure 4A, B, le donneur (souche ^rho-souche synthétique) porte l’allèle ade2 non fonctionnel. Ainsi, le mélange de cytoduction doit être incubé sur une plaque moyenne dépourvue d’adénine. Il s’agit de la plaque maîtresse. ii) Une fois que les colonies se développent, la plaque maîtresse est répliquée à nouveau sur un milieu dépourvu d’adénine (pour générer une nouvelle plaque maîtresse à partir de laquelle les colonies positives d’intérêt seront purifiées), puis sur un milieu où seuls les diploïdes peuvent se développer. Ceci est nécessaire pour éviter une purification ultérieure par inadvertance des colonies diploïdes. Dans le cas de l’exemple de la figure 4C, seuls les diploïdes peuvent se développer sur des milieux dépourvus de leucine. iii) La plaque maîtresse est également répliquée sur des milieux où seuls les haploïdes accepteurs qui ont incorporé l’ADN mitochondrial d’intérêt se développeront. Dans l’exemple de la figure 4C, les haploïdes se développent sur des milieux respiratoires contenant de l’éthanol/glycérol comme source de carbone puisque la protéine Cox1ΔC15 est fonctionnelle. La souche rho⁺ résultante portant l’ADNmt d’intérêt a été nommée XPM209²⁵. Les souches utilisées à la figure 2 et à la figure 4 sont énumérées dans le tableau 1.

Figure 2 : Schéma décrivant un exemple spécifique de transformation mitochondriale et de sélection de rhocellules positives. (A) La modification intentionnelle du génome mitochondrial était une délétion de la région codant pour les 15 derniers acides aminés de la sous-unité Cox1 (Cox1ΔC15). (B) Les WP ont été recouverts de deux plasmides pour transformer les cellules de levure. L’un était le plasmide de 2 μ Yep352 qui était dirigé et exprimé dans le noyau. L’autre était le plasmide pXPM61, qui contient l’allèle COX1ΔC15 plus 395 nt et 990 nt des COX1 5′ et 3′-UTR, respectivement. (C) Les WP ont été introduits dans des cellules à partir de la souche NAB69, qui n’a pas d’ADN mitochondrial (souche rho⁰). Les colonies transformantes obtenues à partir des plaques de bombardement ont été répliquées sur un milieu dépourvu d’uracile, le marqueur auxotrophe du plasmide nucléaire YEp352. (D) Pour sélectionner les ^rhocolonies positives, la plaque -URA a été répliquée sur un milieu dépourvu d’uracile. C’était la plaque maîtresse à partir de laquelle les colonies positives étaient prélevées et isolées. Il a également été reproduit sur des plaques avec des milieux riches (YPD) et une pelouse d’une souche testeur. Au cours de l’accouplement, l’ADN rho-mitochondrial synthétique a été recombiné avec l’ADN mitochondrial de la souche testeuse, L45²⁷, qui porte une mutation du gène COX1 (D369N). Les diploïdes qui se sont développés sur les milieux respiratoires contenaient l’ADN transformé. Les colonies correspondantes ont été prélevées sur la plaque maîtresse pour se reposer et se purifier. Pour aider à identifier les colonies positives dans la plaque maîtresse dans toutes les répliques de placage, des marques ont été faites avec un marqueur permanent sur les bords des plaques (lignes vertes). (E) Les colonies positives sélectionnées ont été restasonnées sur un milieu dépourvu d’uracile. C’était la nouvelle plaque maîtresse. Comme pour D, deux autres séries d’essais ont été effectuées pour purifier ^{les rhocolonies} synthétiques. Abréviations : WPs = particules de tungstène ; ADNmt = ADN mitochondrial ; -URA/Sorb = manque d’uracile / contenant du sorbitol ; WT = type sauvage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Schéma décrivant la procédure de cytoduction. (A) Vue d’ensemble de la façon dont les cellules s’accouplent pendant la cytoduction. Au cours de la cytoduction, les mitochondries des souches donneuse et accepteuse fusionnent de sorte que l’ADN mitochondrial des deux souches se recombine. Comme la fusion nucléaire est réduite en raison de la mutation 30 de kar1-1, des zygotes binucléaires se forment. Après un certain temps d’incubation/récupération, le bourgeon zygote binucléaire et les accepteurs haploïdes contenant la mutation mitochondriale voulue sont sélectionnés. (B) L’accouplement de la souche synthétique rho^– (donneur) et de la souche accepteuse par cytoduction permet la formation de shmoos (flèches rouges), une forme caractéristique de la levure d’accouplement. L’image a été prise au microscope optique avec un objectif 100x. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 : Schéma décrivant un exemple spécifique de cytoduction pour intégrer la mutation COX1ΔC15 dans le génome mitochondrial. (A) Des cultures liquides de la souche rho^– synthétique (donneur, XPM199) et de la souche d’intérêt (accepteur, XPM10) ont été mélangées pour s’accoupler. Après la formation du shmoo, le mélange a été récupéré dans une culture liquide pendant 2 à 4 h. Ensuite, le mélange de cytoduction a été étalé sur une plaque avec un milieu dépourvu d’adénine pour empêcher la croissance des cellules donneuses. (B) Représentation schématique des événements de recombinaison de l’ADN mitochondrial du donneur (XPM199) et de l’accepteur (XPM10) pendant la cytoduction. (C) La plaque maîtresse a été répliquée sur différents milieux sélectifs pour identifier et purifier les haploïdes qui intégraient le gène mitochondrial prévu dans l’ADN de l’organite (XPM209)²⁵. Abréviations : -ADE = manque d’adénine ; -LEU = manque de leucine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.