使用实时荧光显微镜定量人结肠类器官中细胞因子诱导的细胞死亡

作为标准护理的一部分，从接受常规结肠镜检查的 CD 患者中收集结肠粘膜活检。使用患者组织样本和从这些样本中生成结肠类器官系的伦理批准已获得科克教学医院 （CREC） 临床研究伦理委员会的批准。根据赫尔辛基宣言，获得所有患者的书面知情同意书。所有与患者活检和结肠样细胞相关的组织培养工作都必须按照 BSL2 安全方案在生物安全柜内进行。确保所有塑料磨损在使用前都是无菌的。有关本协议中使用的所有材料、试剂、仪器和软件的详细信息，请参阅 材料表 。 我们小组用于隐窝分离和类器官培养的方案改编自已建立的方法14、15、16，并且之前已发表9、10、17。对于以下方案，使用类器官增殖培养基培养结肠素（表 1）。使用类器官增殖培养基生长的结肠素是未分化的，并且富含结肠干细胞。类器官增殖培养基的主要成分是 50% L-WRN 条件培养基，其中包含肠道干细胞生态位生长因子 Wnt-3A （W）、R-spondin 3 （R） 和 Noggin （N）15。类器官增殖培养基的制备方法是将 L-WRN 条件培养基和无血清培养基 1：1 混合，然后补充烟酰胺和化学抑制剂（表 1）。 1. 结肠隐窝分离和结肠样培养 在用隐窝接种之前，将 48 孔微量滴定板在 37 °C、5% CO2 下预孵育至少 72 小时。注：预孵育板可加速接种过程中基底膜提取物 （BME） 的聚合。 在分离隐窝的前一天晚上，在 4 °C 的冰上解冻 BME。 将结肠活检收集在含有 15 mL 活检采集培养基（表 1）的样品收集管中，并在 4 °C 下储存直至准备好处理。 使用移液管小心地去除尽可能多的活检采集培养基。向样品管中加入 15 mL 补充有 2.5 μg/mL 两性霉素 B 和 100 μg/mL 庆大霉素的冰冷 DPBS，清洗活检。用力摇晃样品管，以去除活检中的任何粘液或碎屑。让活检在重力下沉降，并使用移液管小心去除尽可能多的 DPBS。从步骤 1.4 开始重复洗涤程序两次 （2x）。 向样品管中加入 10 mL 补充有 2.5 μg/mL 两性霉素 B 和 200 μg/mL 庆大霉素的无酶细胞解离试剂，并在室温下以 30 rpm 摇动孵育 15 分钟。 孵育后，用手左右用力摇晃样品管以释放结肠隐窝。使用低倍光学显微镜检查试管，并寻找释放的隐窝和悬浮的隐窝碎片。如果看不到，请摇动试管并再次检查;重复直到看到隐窝处于悬浮状态。 将 70 μm 细胞过滤器连接到 50 mL 试管上，并通过过滤器过滤隐窝悬液。将 10 mL 冰冷的类器官洗涤培养基（表 1）添加到空样品管中，取出培养基，然后将其通过细胞过滤器。 将过滤后的隐窝转移到两个 15 mL 管（每管 10 mL）中，并在 4 °C 下以 150 × g 离心 5 分钟。 小心地从每个 15 mL 试管中取出上清液，将隐窝沉淀重悬于 500 μL 冰冷的类器官洗涤培养基中，将隐窝溶液从两个 15 mL 试管转移到单个 1.5 mL 微量离心管中，并在 4 °C 下以 400 × g 离心 3 分钟。 小心地从微量离心管中取出上清液，并将隐窝沉淀重悬于 70 μL BME（每孔 20 μL 和 10 μL 额外死体积）中。 使用预孵育的 48 孔板（步骤 1.1），将 20 μL BME/crypt 悬浮液接种到每个孔的中心（每孔 1 个 BME 圆顶）。平稳稳定地倒置板，并在 37 °C、5% CO2 下孵育 20 分钟。注：倒置板可防止细胞粘附在孔的塑料表面，并确保它们在 BME 内的分布。 从培养箱中取出板。确保 BME 已完全聚合，然后用 350 μL 预热的类器官增殖培养基覆盖圆顶，并补充有 100 μg/mL 的广谱抗菌试剂。将板在 37 °C、5% CO2 下孵育。注：广谱抗菌试剂用于防止与结肠活检相关的粘膜微生物污染。仅在隐窝隔离后的第一周培养才需要。 使用预热的类器官增殖培养基在一周内更换培养基 2-3 次，并在培养的第一周补充广泛的抗菌试剂;在此期间后，取出试剂。 一旦结肠样培养物完全建立（分离后 1-2 周），使用补充有 10 μM ROCK-I/II 抑制剂 Y-27632 的酶解离试剂解离结肠素（有关结肠样解离的完整详细信息，请参见第 2 节）。注意：对于前两次传代（P0-1、P1-2），应使用 1：1/2 的比例扩增结肠;P2 后，结肠样化合物可以以 1：3/4 的比例传代。 按照步骤 1.11-1.13 接种并维持结肠素（不要用广泛的抗菌试剂补充类器官增殖培养基）。 2. 制备用于细胞死亡测定的结肠素 注意：细胞死亡测定方案需要 4 天才能完成（图 1A）。 使用 48 孔板形式扩增结肠素，每孔接种 20 μL BME/隐窝悬浮液，在 37 °C、5% CO2 下孵育，每周更换培养基 2-3 次（每孔 350 μL）。 在收获细胞死亡测定前约 1 周传代结肠素。在收获结肠素之前，确保它们繁殖到高密度（图 1Bi），它们的直径约为 25-50 μm，并且正在积极增殖。注意：我们从第 3 次传代到第 14 次传代使用结肠素进行该测定，结果一致。然而，已经证明结肠样化合物对细胞因子的转录反应会根据培养持续时间而变化18。在此基础上，我们建议在第 15 代后不要使用结肠素进行该测定。 在用结肠样细胞接种之前，将 96 孔微量滴定板在 37 °C、5% CO2 下预孵育至少 72 小时。 在开始实验前一天晚上，在 4 °C 的冰上解冻 BME。 通过补充 10 μM 的 ROCK-I/II 抑制剂 Y-27632，制备足够体积的酶解离试剂（每孔结肠素 500 μL）。从含有结肠素的孔中轻轻去除培养基;从孔边缘移液，以避免损坏结肠样圆顶。向每个孔中加入 300 μL 酶解离试剂。对于每个孔，用 P1000 移液器的尖端刮擦孔表面并上下移液细胞悬液，从而打破结肠样圆顶;尽量避免产生气泡。将细胞悬液收集在 15 mL 试管中。注意：该 15 mL 管将用于从 48 孔板的 10 个孔中收集结肠素。 用另外 200 μL 酶解离试剂清洗相同的孔，以确保收集所有结肠样材料并转移到同一个 15 mL 试管中。对正在收获的扩增结肠素的每个孔重复此过程，并将它们收集在同一个 15 mL 管中。注意：为了有效解离，每管最多应收集 10 个结肠素孔。如果收集 >10 个孔，将收集的结肠素平均分装在多个 15 mL 试管中。 将 15 mL 试管与步骤 2.5.2 中收集的定型物在 37 °C 的水浴中孵育 5 分钟。孵育后，将试管以 400 × g 离心 3 分钟。轻轻去除上清液，在试管中留下大约 1.2 mL。注意：下一步需要使用快速移液对结肠素进行物理解离。为了有效，试管中必须有少量细胞悬液 – 15 mL 试管中剩余的 1.2 mL 就足以达到此目的。 将结肠样沉淀重悬于剩余的 1.2 mL 酶解离试剂中。使用设置为 1,000 μL 的 P1000 移液器，将移液器吸头放入悬浮液中，将其保持在 15 mL 试管底部刚好上方，然后快速将悬浮液移入和移出吸头。要快速移液，请快速按下柱塞按钮至第一个停止位置，松开按钮，直到它大约到达顶部位置的一半，然后重复。快速移液约 10 秒（30-40 次下降），然后完全重悬悬液并重复移液。进行 2-3 轮快速移液。 在显微镜下检查样品，确认没有留下完整的结肠样体，并且大多数结肠样片段的大小约为 30-40 μm（图 1Bii）。 如果样品需要进一步解离，请在 37 °C 的水浴中再孵育 3 分钟，重复步骤 2.7 中的移液技术，并在显微镜下检查样品。重复此过程，直到大多数结肠样片段达到最佳大小。注意：注意不要过度解离结肠素，因为这会导致细胞过度死亡、接种效率低和结肠素尺寸过小。 向 15 mL 试管中加入 10 mL 冰冷的类器官洗涤培养基（表 1）。将试管以 400 × g 离心 3 分钟，去除上清液，重悬于 1 mL 冰冷的类器官洗涤培养基中，然后转移到 1.5 mL 微量离心管（称为 结肠样碎片管）中。 通过移液混合 结肠样片段管 的内容物，并取 50 μL 样品;将该 50 μL 样品转移至新的 1.5 mL 微量离心管（称为 细胞计数管）中。从这一点开始，将 结肠样碎片管 储存在冰上，直到步骤 2.15 完成。 将 细胞计数管 以 400 × g 离心 3 分钟，去除上清液，然后重悬于 500 μL 补充有 10 μM ROCK-I/II 抑制剂 Y-27632 的酶解离试剂中。 将单 细胞计数管 在 37 °C 的水浴中孵育 5 分钟。使用设置为 400 μL 的 P1000 移液器，按照步骤 2.7 中的说明移液样品，并在显微镜下检查样品以确保存在单细胞悬液。如果没有，请重复此过程，直到结肠类化合物完全解离成单细胞悬液。 向单 细胞计数管中加入 1 mL 类器官洗涤培养基，以 400 × g 离心 3 分钟，然后小心去除上清液。将细胞重悬于 50 μL 类器官洗涤培养基中，然后加入 50 μL 台盼蓝。 使用血细胞计数器计数细胞。计算 50 μL 样品中的细胞数量，并使用它来计算 结肠样片段管中的细胞浓度。 计算实验所需的细胞悬液体积，其中 96 孔微量滴定板每孔将接种 0.5 ×10 4 个结肠样细胞。在此计算的体积中增加大约 15% 的额外内容，以考虑死体积。将此总体积从 结肠样碎片管 （步骤 2.11）转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。将含有结肠样片段的新型 1.5 mL 微量离心管以 400 × g 离心 3 分钟，去除上清液，然后重悬于 BME 中（每 0.5 × 104 个细胞使用 10 μL BME）。注：由于 BME 的物理特性（高粘度、温度依赖性聚合），移液可能会损失大量材料（死体积）。 将含有结肠样体/BME 悬浮液的试管或储液槽放在生物安全柜内的无菌容器中。注意：接种时将细胞保持在冰上可防止细胞底物过早聚合。 使用预孵育的 96 孔微量滴定板（来自步骤 2.3），每孔反向移液 10 μL 结肠样化合物/BME 溶液。确保将吸头放在孔表面的正上方，并将移液管移入中心，以避免撞到孔壁。定期混合结肠素/BME 悬浮液以防止接种不均匀。注意：不要在微量滴定板的外边缘孔中接种结肠素。反向移液：设置移液器，然后按下柱塞按钮，越过第一个挡块到第二个挡块。 保持此位置，将吸头浸入结肠/BME 悬液中，然后慢慢将柱塞释放到顶部。 轻轻稳定地将柱塞按钮按到第一个停止位置，分配悬浮液。如果播种更多孔，请保持此位置并重复步骤 2.18.1.2-2.18.1.3。 完成后，将柱塞按钮按到第二个挡块，排出少量剩余的悬浮液。注意：由于 BME 的高粘度，我们建议使用反向移液技术。 平稳稳定地倒置板，并在 37 °C、5% CO2 下孵育 20 分钟。 从培养箱中取出板。确保 BME 已完全聚合，然后用 200 μL 预热的类器官增殖培养基覆盖圆顶。如果使用带有周围护城河（减少蒸发）的 96 孔微量滴定板，请用 2 mL 类器官洗涤培养基填充每个储液槽。 将结肠样化合物在 37 °C、5% CO2 下孵育 3 天，每天显微镜检查一次，以确保结肠样结肠素已恢复并增殖。 3. 用于细胞死亡测定的结肠样处理 通过将荧光细胞死亡染料或 DMSO 添加到预热的类器官增殖培养基中，制备 2.5 μM 荧光细胞死亡染料（SYTOX Green 核酸染料）和 DMSO 溶液（表 2）。注：保护荧光细胞死亡染料原液和稀释溶液避光。SYTOX Green 核酸染色剂溶于 DMSO 中;DMSO 溶液用于制备无染料条件，以控制溶剂效应。 使用步骤 3.1 中的 2.5 μM 荧光细胞死亡染料和 DMSO 溶液制备处理，如 表 2 所示。 通过倾斜板并从孔边缘移液，从接种有结肠素的 96 孔微量滴定板中轻轻去除培养基;然后，每孔添加 200 μL 处理培养基。确保在最大毒性条件下有额外的 PBS/BSA 对照孔（板图见 表 2）。 将结肠素在 37 °C、5% CO2 下孵育所需的处理时间点，直到准备好成像。 至少在成像前 2 小时，在无菌细胞培养级水中制备 10% v/v 的 Triton-X 100 溶液，并将 22 μL 的 10% Triton-X 100 直接添加到最大毒性条件下的对照孔培养基中，至终浓度为 1% v/v成像前 1 小时。注：使用 10% 溶液可减少由于表面活性剂的高粘度而可能出现的移液误差。 4. 图像采集 从培养箱中取出接种有结肠素的 96 孔微量滴定板，并转移到数字倒置落射荧光显微镜的载物台上。让板达到室温。 通过在显微镜下检查结肠素，确认 Max Toxicity 条件结肠素已完全裂解（图 1Biii）。 选择合适的物镜，例如长工作距离 40 倍荧光物镜。在开始之前优化显微镜的成像设置。使用传输通道，专注于具有 SYTOX 阳性细胞的结肠样蛋白，切换到绿色荧光蛋白 （GFP）通道 （488 nm），并调整光强度和曝光时间，以最大限度地提高荧光信号，同时最大限度地减少背景。首先，尝试低光强度，然后逐渐增加曝光时间;如果曝光时间不切实际，则稍微增加光强度。注意：增加曝光时间而不是光强度将降低样品的光毒性和光漂白19.仅在必要时将样品暴露在荧光灯下。 使用 GFP 通道的优化成像设置，观察 No Dye 和 Max Toxicity 条件，以确保样品不会曝光过度或曝光不足。完成后，请保持不同条件之间的成像设置一致。 使用随机采样方法采集图像：通过选择遵循覆盖结肠样圆顶的固定网格模式的视野 （FOV） 来执行此操作。从至少 10 个 FOV 获取结肠体的图像。确保结肠体的中心平面聚焦并在透射和 GFP 通道中获取图像。应用以下排除标准。如果 FOV 中不存在结肠，请不要获取图像。 如果 FOV 中存在的同一焦平面中只有重叠的结肠，请不要获取图像（图 1Biv）。 如果 FOV 中仅存在结肠样碎片，请不要获取图像（图 1Bv）。不要在分析中包括结肠样碎片。 以便携式网络图形格式保存图像并导出。 如果对其他时间点进行成像，请将带有结肠素的 96 孔微量滴定板放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中。 5. 图像分析 打开 Fiji ImageJ 并通过将文件拖放到 ImageJ 工具栏上或导航到文件 |打开 并选择文件。打开后，单击 Image|堆栈|要堆叠的图像。通过单击将图像堆栈转换为 8 位文件格式 Image|类型 |8 位。 对于每个图像集，单击 ImageJ 工具栏上的 手绘选择 工具，然后使用计算机鼠标手动选择透射图像上的感兴趣区域 （ROI）;ROI 是结肠体的周长。然后，在图像堆栈之间切换到相应的 GFP 通道图像。 单击 Analyze（分析）|设置度量;在 Set Measurements 对话框窗口中，勾选 Mean Gray Value 并取消勾选所有其他框。选择 GFP 图像后，单击 Analyze |测量。对图像堆栈中的每个结肠重复此分析。分析数据集后，复制 Results （结果 ） 窗口中的所有数据并将其粘贴到电子表格软件应用程序中。 6. % 最大毒性计算 使用方程 （1） 计算每种条件的技术仿行灰度均值 （MGV） 的均值。 （处理 A 的均值） = （1） 使用公式 （2） 将每个条件的平均值表示为相对于最大毒性条件 （MT） 平均值的百分比。%MTa = （2） 7. 计算 CPI 使用步骤 6.1 中计算的平均值，按如下方式对数据进行归一化 （NORM），从每个处理条件和最大毒性 （MT） 条件中减去未处理条件 （UT） 的平均值（以去除独立于细胞因子处理发生的背景细胞死亡）。然后，将每个处理条件除以最大毒性 （MT） 条件的背景减去平均值，如等式 （3） 所示。范数a = （3） 从 1 中减去步骤 7.1 中计算的标准化值;所得值代表处理后的细胞活力 （V）（如下面的公式 （4） 所示）。Va = 1 −范数 a （4） 使用公式 （5） 计算 perturbagen 相互作用系数 （CPI）：CPI = （5）其中 a 表示第一次处理; b 表示第二种处理; AB 是联合治疗。CPI 值表示协同 （1） 关系。