Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly <i>Bradysia (Sciara) coprophila</i>: A New/Old Emerging Model Organism

Susan  A. Gerbi

doi:10.3791/66751

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Biologie

Maintenance en laboratoire de la mouche des diptères inférieurs Bradysia (Sciara) coprophila : un organisme modèle nouveau/ancien émergent

Published: April 19, 2024

doi:

10.3791/66751

Susan A. Gerbi

¹Department of Molecular and Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

Summary

Cet article décrit l’entretien en laboratoire (y compris l’accouplement et l’alimentation) de la mouche diptère inférieur Bradysia (Sciara) coprophila.

Abstract

Les stocks de laboratoire de la mouche des diptères inférieurs, Bradysia (Sciara) coprophila, sont maintenus depuis plus d’un siècle. Les protocoles d’entretien de B. coprophila en laboratoire sont présentés ici. Ces protocoles seront utiles au nombre croissant de laboratoires qui étudient B. coprophila pour tirer parti de ses caractéristiques biologiques uniques, notamment (1) un fuseau monopolaire dans la méiose mâle I ; (2) la non-disjonction de la dyade X dans la méiose masculine II ; (3) l’empreinte chromosomique pour distinguer les homologues maternels des homologues paternels ; (4) chromosomes (L) limités par la lignée germinale ; (5) l’élimination des chromosomes (chromosomes paternels dans la méiose I masculine ; un à deux chromosomes X chez les embryons précoces ; Chromosomes L du soma chez les embryons précoces) ; (6) la détermination du sexe par la mère (il n’y a pas de chromosome Y) ; et (7) l’amplification de l’ADN régulée par le développement au niveau des loci de l’ADN dans les chromosomes polytènes des glandes salivaires larvaires.

Il est maintenant possible d’explorer ces nombreuses caractéristiques uniques de la mécanique chromosomique en utilisant les progrès récents dans le séquençage et l’assemblage du génome de B. coprophila et le développement d’une méthodologie de transformation pour l’ingénierie génomique. La communauté scientifique croissante qui utilise B. coprophila pour la recherche bénéficiera des protocoles décrits ici pour l’accouplement des mouches (marqueurs phénotypiques pour les mères qui n’auront que des fils ou des filles uniques ; détails de l’accouplement de masse pour les expériences biochimiques), la vérification de l’éclosion des embryons, l’alimentation des larves et d’autres commentaires sur son élevage.

Introduction

Une compréhension complète des principes biologiques nécessite l’étude de nombreux organismes divers couvrant l’arbre de la vie. Bien qu’un large éventail d’organismes ait été décrit jusqu’à la fin du^{XIXe siècle,} au milieu du^{XXe siècle,} les études expérimentales se sont limitées à une poignée de moins d’une douzaine d’organismes modèles. Avec l’avènement de l’ère génomique et l’objectif de séquencer les génomes de toutes les espèces dans l’Arbre de la Vie¹, nous sommes maintenant en mesure d’élargir les types d’organismes utilisés pour les expériences en laboratoire et de tirer parti de leur diversité. Une telle expansion d’organismes modèles émergents pour les expériences a une condition préalable à leur maintien en laboratoire. Ici, des protocoles sont décrits pour l’élevage d’un tel organisme modèle émergent, nouveau/ancien.

La majorité de la vie animale sur Terre est représentée par quatre super-radiations d’insectes². Parmi les insectes, il existe environ 158 000 espèces de diptères (mouches vraies)³, avec environ 3000 espèces dans la famille des Sciaridae (mouches du terreau noir)⁴. La drosophile est la plus étudiée des mouches diptères. La mouche diptère inférieure (Nematocera), Bradysia (anciennement appelée Sciara) coprophila, a divergé il y a 200 millions d’années de la drosophile, qui est une mouche « diptère supérieur » (Brachycera). Par conséquent, B. coprophila est dans une position taxonomique favorable pour les études comparatives avec D. melanogaster (Figure 1). De plus, B. coprophila possède de nombreuses caractéristiques biologiques uniques qui méritent d’être étudiées à part entière ^5,6,7. Beaucoup de ces caractéristiques désobéissent à la règle de constance de l’ADN dans laquelle toutes les cellules d’un organisme ont le même contenu en ADN. Chez B. coprophila, (i) le génome paternel est éliminé sur un fuseau monopolaire dans la méiose I mâle ; (ii) il n’y a pas de disjonction de la dyade X dans la méiose II masculine ; (iii) les chromosomes (L) limités à la lignée germinale sont éliminés du soma ; et (iv) un ou deux chromosomes X sont éliminés dans l’embryon précoce en fonction du sexe de l’individu. L’empreinte chromosomique permettant de distinguer les homologues maternels des homologues paternels a été découverte pour la première fois chez B. coprophila et est à l’origine de bon nombre de ces événements d’élimination chromosomique. En plus de l’élimination des chromosomes, un autre contournement de la constance de l’ADN se produit via l’amplification de l’ADN régulée par le développement et spécifique au locus au niveau des loci de la bouffée d’ADN dans les chromosomes polytènes des glandes salivaires larvaires. L’étude de ces caractéristiques uniques nécessite l’entretien en laboratoire de B. coprophila ; Les détails de son élevage sont présentés ici pour faciliter ces études.

Figure 1 : Phylogénie de Bradysia (Sciara) coprophila. Les organismes modèles populaires sont indiqués en bleu et leur ordre taxonomique en rouge. Bradysia et d’autres mouches sciarides ainsi que les moustiques sont des mouches diptères inférieures (anciennement sous-ordre des Nematocera), tandis que les espèces de drosophiles sont des mouches diptères supérieures (sous-ordre : Brachysera). L’information sur le côté gauche de la figure provient de Misof et ^al.33 ; les informations du côté droit proviennent de Bertone et ^al.34 et de Wiegmann et ^al.2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Auparavant, le genre Sciara comptait le plus grand nombre (700) d’espèces pour tous les eucaryotes, ce qui a incité Steffan à les subdiviser^{en 8}. Par la suite, Shin a proposé que la famille des Sciaridae soit subdivisée en la sous-famille des Sciarinae (avec six genres dont Sciara, Trichosia et Leptosciarella), la sous-famille des Megalosphyinae (y compris le genre Bradysia) et trois autres groupes (y compris Pseudolycoriella)⁹. La phylogénie des Sciaridae a été étudiée plus avant par plusieurs groupes ces dernières années ^9,10,11. Au cours des dernières décennies, les noms de nombreux organismes de la famille des Sciaridae ont changé¹². Bien que la majeure partie de la littérature couvrant plus d’un siècle fasse référence à l’organisme que nous étudions sous le nom de Sciara coprophila, son nom taxonomique actuel est maintenant Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola et autres synonymes)¹⁰. Ils se trouvent dans le monde entier et sont communément appelés moucherons fongiques car ils mangent des champignons et d’autres champignons. Ils ont été décrits pour la première fois en 1804 par Meigen¹³ en Europe, puis par Johannsen ^14,15 en Amérique du Nord. B. coprophila a été récolté au laboratoire de Cold Spring Harbor et des stocks de laboratoire ont été établis par Charles Metz au début des années 1900 alors qu’il était étudiant diplômé à l’Université Columbia avec Thomas Hunt Morgan. Ainsi, les stocks actuels reflètent un siècle de consanguinité. De même, la biologie de B. coprophila a été élucidée par des décennies d’études cytogénétiques menées par Helen Crouse (qui a fait son travail de doctorat avec Barbara McClintock).

Dans les années 1930, Bradysia (Sciara) a concurrencé Drosophila melanogaster en tant que système modèle pour les études génétiques. Malgré ses nombreuses caractéristiques biologiques uniques, B. coprophila a été éclipsé par D. melanogaster en tant qu’organisme modèle populaire, car les mutations phénotypiques induites par les radiations étaient nécessaires pour les études génétiques et étaient plus faciles à réaliser dans ces dernières, même si B. coprophila n’est que légèrement plus résistant à l’irradiation gamma que D. melanogaster¹⁶. À l’ère moderne de la génomique, ce n’est plus une préoccupation. Étant donné que la séquence^génomique 17,18,19 (Urban, Gerbi et Spradling, données non présentées) et les méthodes de transformation ^20,21 (Yamamoto et Gerbi, données non présentées) pour B. coprophila sont récemment devenues disponibles, le moment est maintenant venu de l’utiliser comme un système modèle émergent nouveau/ancien, comme le montre la communauté croissante de scientifiques qui l’ont adopté pour leurs recherches. Cet article décrit les procédures d’entretien de son laboratoire.

B. coprophila n’a pas de chromosome Y et le sexe de la progéniture est déterminé par la mère. Les femelles qui ont le chromosome X’ (« X-prime ») avec une longue inversion paracentrique n’auront que des filles, tandis que les femelles qui sont homozygotes pour le chromosome X standard (non inversé) n’auront que des fils⁵ (Figure 2). Des informations sur la séquence sont disponibles pour le chromosome¹⁹ de l’X, mais le mécanisme moléculaire reste à élucider sur la façon dont le chromosome X détermine que la progéniture sera femelle. Les mâles n’ont jamais le chromosome X’, et après fécondation, les femelles sont X’X (hétérozygote pour le X’) ou XX. Les femelles X’X adultes se distinguent des femelles XX par des marqueurs phénotypiques sur l’aile (Figure 3). Les femelles X’X (qui n’auront que des filles) sont reconnaissables au marqueur dominant de l’aile ondulée (W) sur le X’ (comme dans la crosse HoLo2)²². Alternativement, les femelles XX (qui n’auront que des fils) peuvent être reconnues par le marqueur d’aile petite (p) récessive sur le X comme dans la crosse^{91S 23}. Dans ce cas, les femelles X’Xp auront des ailes pleine longueur (pas petites) et n’auront que des filles. La crosse 6980 porte un marqueur récessif sur le chromosome X pour les veines gonflées (sw)²⁴, ainsi que le marqueur dominant ondulé sur le X’, permettant deux marqueurs pour la sélection pour les croisements. Le degré d’expression de Wavy peut varier et semble plus faible dans les flacons surpeuplés où la nourriture est limitative ou si la température devient trop chaude. Le phénotype de l’aile ondulée est exceptionnellement fort si les larves sont gardées dans la chambre froide (4°-8 °C) au lieu des 21 °C habituels. Bien que le marqueur récessif de la petite aile ne soit pas variable et soit très facile à identifier, les souches 91S sont moins utilisées car elles sont moins saines que les souches HoLo2. Les schémas d’accouplement de B. coprophila sont présentés ici (figure 2) et décrits en détail pour les stocks HoLo2, 7298 et W14 (fichier supplémentaire 1), le stock 91S (fichier supplémentaire 1), le stock 6980 (fichier supplémentaire 1) et les stocks de translocation (fichier supplémentaire 1). Les stocks de translocation n’existent plus ; il s’agissait de translocations réciproques d’hétérochromomères (H1, H2 et H3) sur le bras court du X qui contient les gènes de l’ARN ribosomique 25,26,27.

Figure 2 : Schéma d’accouplement de B. coprophila. Cet organisme n’a pas de chromosome Y (le soma mâle a un seul X) ; Les mères déterminent le sexe de leur progéniture. Les XX mères n’ont que des fils et les femmes X’X n’ont que des filles. Le chromosome X a une longue inversion paracentrique par rapport au chromosome X. La lignée paternelle ou maternelle du chromosome X (ou X’) est indiquée respectivement par du bleu ou du rouge dans cette figure. Les spermatozoïdes sont haploïdes pour les autosomes mais ont deux copies du chromosome X en raison de la non-disjonction dans la méiose II. La lignée somatique des embryons précoces élimine une ou deux copies du X d’origine paternelle, qu’ils soient respectivement féminins ou masculins. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Phénotypes des ailes de B. coprophila. Les mouches femelles adultes présentent différents phénotypes d’ailes : (A) aile droite (XX), (B) aile ondulée (_X’WX), (C) aile ondulée extrême (_X’WX) phénotype qui a un aspect ratatiné après avoir stocké les larves dans le room froid, (D) petite aile (XpXp) qui ressemble à un vestigial, (E) aile droite avec type sauvage (XX) et veines non gonflées, (F) aile droite avec des veines enflées (XswXsw) où de petites bulles (flèches noires) apparaissent sur le bord supérieur de l’aile et/ou près de l’extrémité des deux ailes, (G) exemple extrême de gonflement où une cloque (flèche blanche) apparaît sur une ou les deux ailes. Les mâles n’ont pas le chromosome X’ et n’auront donc jamais d’ailes ondulées, mais ils ont des ailes petites ou gonflées dans la crosse 91S ou la crosse 6980, respectivement. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’objectif de la maintenance du stock est d’effectuer des croisements où la moitié des croisements proviennent de mères productrices de femelles et l’autre moitié de mères productrices de mâles afin d’avoir un nombre égal d’adultes femelles et mâles dans la génération suivante pour les croisements ultérieurs. Cependant, cela implique également une planification, car le cycle de vie des mâles est plus court que celui des femelles et les mâles adultes émergent jusqu’à une semaine avant les femelles adultes. La nature s’accommode de cette asynchronie entre les sexes en faisant émerger les embryons mâles sous forme de larves 1 à 2 jours après les larves femelles d’un croisement à la même date. Cependant, pour s’assurer que les adultes mâles et femelles sont disponibles en même temps pour les croisements en laboratoire, le développement des femelles peut être quelque peu accéléré en laissant les flacons contenant des larves femelles à température ambiante plutôt qu’à 21 °C ou en plaçant les flacons contenant des larves mâles à des températures légèrement plus fraîches (p. ex. 16 °C). Une autre voie plus infaillible est de faire des croisements avec des mères productrices le lundi et des croisements avec des mères productrices mâles le vendredi de la même semaine. La voie la plus simple, c’est celle que nous utilisons, est d’effectuer des croisements avec des mères productrices et des mères productrices mâles le même jour chaque semaine et d’effectuer des croisements ce jour-là chaque semaine consécutive. Dans cette approche, les femelles adultes issues d’un croisement à la semaine 1 peuvent être accouplées avec des mâles adultes issus d’un croisement à la semaine 2.

Le cycle de vie de la femelle B. coprophila est de 5 semaines lorsqu’elle est élevée à 21 °C (tableau 1). La durée de leur cycle de vie est un peu plus longue à des températures plus fraîches ou s’ils sont sous-alimentés. Le cycle de vie des mâles B. coprophila est de ~4 à 4,5 semaines puisqu’ils se nymphosent 0,5 à 1 semaine avant les femelles. L’extrémité de chaque stade larvaire est marquée par l’excrétion de la cuticule, qui est déclenchée par une explosion du niveau de l’hormone stéroïde ecdysone. Contrairement à D. melanogaster, qui a trois stades larvaires, B. coprophila a quatre stades larvaires.

Stade de développement	Jours après l’accouplement (dpm)	Durée de l’étape (jours)
Oeuf pondu	1-2
Embryon	1-2 à 7-8	~7 jours
Larve
Stades larvaires 1, 2 et 3	7-8 à 16-19	~10
4e stade larvaire pré-oculaire	16-19 au 21-24	5
4e stade larvaire du pronostic larvaire	21-24 au 25-28	4
Chrysalide	25-28 à 30-33	5
Adulte	vit 1 à 2 jours à 21 °C s’il est accouplé ou vit 2 à 3 semaines à 16 °C s’il n’est pas accouplé.

Tableau 1 : Cycle de vie de la femelle B. coprophila à 21 °C.

B. coprophila peut être conservé n’importe où dans la plage de 15 °C à 25 °C, le développement progressant plus lentement à des températures plus froides. Cet insecte préfère un environnement humide (se trouvant dans le sol des plantes d’intérieur ou des plates-bandes de champignons), nous gardons donc un bécher avec de l’eau déminéralisée dans l’incubateur. B. coprophila peut être conservé à température ambiante dans une boîte à pain en métal avec un couvercle lâche et contenant un bécher d’eau, mais ils subissent un choc thermique à 37 °C²⁸, ce qui est un danger dans les climats chauds. Michael Ashburner et d’autres ont essayé, sans grand succès, de stocker D. melanogaster au froid pour réduire le temps nécessaire à la tenue des stocks. En revanche, un avantage majeur de B. coprophila est que les flacons contenant des larves à un stade intermédiaire peuvent être conservés jusqu’à 3 mois sur une étagère ouverte dans la chambre froide (4-8 °C) avec un soin minimal de ne nourrir qu’une fois par mois. Ils se développent extrêmement lentement dans le froid jusqu’au stade nymphal et émergeront en adultes fertiles lorsque les flacons seront ramenés à 21 °C. On peut supposer que cela imite leur hivernage dans la nature. Ce retard de développement induit par le froid pourrait être comparable à celui observé après l’irradiation gamma de larves de B. coprophila ¹⁶ à un stade intermédiaire, mais aucun retard de développement n’est observé chez les larves de stade avancé qui ont dépassé le point de non-retour de leur progression normale du développement.

Protocol

Les protocoles décrits ici représentent un siècle d’expérience des centres de stock Bradysia (Sciara) supervisés séquentiellement par Charles Metz, Helen Crouse et Susan Gerbi, ainsi que des contributions d’autres personnes. 1. Croisements d’accouplement Utiliser une femelle adulte et deux mâles adultes par flacon en verre de 28 mm de diamètre. Une fois que 100 % de succès est atteint dans la reconnaissance des phénotypes d’ailes pour les mères qui n’auront que des filles ou des fils, utilisez deux femelles et deux mâles par flacon pour augmenter le nombre de larves/flacons. Ajoutez des femelles dans chaque flacon avant d’ajouter les mâles qui se réveillent plus vite de l’anesthésie que les femelles.REMARQUE : La description ci-dessous suppose que vous avez du CO2 ; Alternativement, l’éther peut être utilisé pour anesthésier les mouches adultes. Si vous utilisez de l’éther pour anesthésier les mouches adultes, collez un tampon de lingettes de laboratoire pliées (par exemple, des kimwipes) à l’intérieur d’un couvercle en verre rond d’un pot Coplin et utilisez un compte-gouttes pour transférer un peu d’éther de la bouteille afin d’humidifier le tampon de lingettes de laboratoire (mais pas saturé et si humide que l’éther liquide en tombera et risquera de noyer les mouches). Pour l’étape 1.6 ci-dessous, placez le tampon d’éther humidifié sur le flacon ouvert pendant ~1 min jusqu’à ce que les adultes cessent de bouger. Une fois que les adultes ont été transférés dans une plaque de carreaux de céramique blanche (utilisée à la place du coussinet anti-mouches blanc), tenez périodiquement (lorsque les pattes des mouches commencent à se contracter) maintenez le coussinet fraîchement humidifié à l’éther sur les mouches sur la plaque (sans toucher) les mouches sur la plaque pendant ~1 min.ATTENTION : L’éther est inflammable et doit être stocké dans une hotte de ventilation et non dans un réfrigérateur. Disposer à portée de main un plateau contenant des flacons de femelles adultes, un plateau contenant des mâles adultes et un plateau de flacons vides contenant 2,2 % (poids/vol) de gélose. Sur la paillasse du laboratoire, placez des affiches indiquant « femelle » ou « mâle » et le phénotype de l’aile de la mère afin que la fiole avec les adultes sélectionnés pour le croisement soit placée dans le bon groupe, où toutes les fioles d’un groupe n’auront qu’une progéniture mâle et toutes les fioles de l’autre groupe n’auront qu’une progéniture femelle.REMARQUE : Assurez-vous qu’il n’y a pas de gouttelettes de condensation à l’intérieur du flacon, car les adultes colleront aux gouttelettes. Si les flacons ont été conservés dans une boîte en plastique, placez-les sur une paillasse de laboratoire à température ambiante pendant au moins 1 h avant de les utiliser pour laisser la condensation s’évaporer. Allumez le gazCO2 et la lampe du microscope de dissection.REMARQUE : Une source lumineuse avec des fibres optiques est préférée car elle émet moins de chaleur, ce qui fait que les mouches anesthésiées se réveillent plus rapidement. Tapotez vigoureusement la fiole avec les adultes sur un tampon en caoutchouc de sorte que les adultes tombent au fond de la fiole et retirez le bouchon ; insérez la buse du pistolet CO2 et rajoutez le bouchon. Appuyez sur la gâchette de la buse pour que le CO2 s’écoule dans le flacon pendant ~1 min pour anesthésier les adultes. Mettez un pied sur la pédale pour que le CO2 s’écoule sur le coussin de mouche blanc plutôt que sur la buse du pistolet. Gardez la pédale enfoncée pendant tout le temps que les mouches sont sur le coussin anti-mouches blanc (ou bien appuyez par intermittence sur la pédale chaque fois que les pattes des mouches commencent à se contracter). Retirez la buse et le bouchon du flacon et retournez le flacon sur un tampon anti-mouches blanc sous un microscope à dissection. Tapotez le fond de la fiole inversée contre le microscope de manière à ce que les adultes tombent de la fiole sur le coussinet anti-mouches blanc. Sélectionnez les adultes les plus gras (récemment fermés avec des abdomens blancs) et utilisez des pinces à pointe fine pour saisir doucement l’adulte par sa patte médiane ou arrière. Ne blessez pas les pattes avant qui sont utilisées pour la danse nuptiale. N’utilisez pas d’adultes qui viennent de s’enfermer et dont le corps est entièrement blanc et n’est pas encore devenu noir, car leurs ailes seront courtes et ne seront pas complètement développées, de sorte que le phénotype de l’aile ne peut pas être évalué. Les adultes avec un abdomen plus mince peuvent toujours être utilisés, bien qu’ils aient une fertilité réduite. N’utilisez pas d’adultes maigres dont les ailes sont levées verticalement loin de leur corps, car ils sont morts. De l’autre main, retirez le bouchon du flacon avec de la gélose à 2,2 % (poids/vol). Avec la main tenant la pince avec l’adulte, tapotez vigoureusement la pince contre la paroi intérieure supérieure de la fiole de sorte que l’adulte tombe au fond de la fiole. Remettez le bouchon dans le flacon. Répétez les étapes 1.5 à 1.11 ci-dessus pour configurer chaque flacon contenant des femelles adultes. À l’aide d’un pinceau, balayez les mouches inutilisées du coussinet anti-mouches blanc dans leur flacon parent. Cochez l’étiquette du flacon parent pour indiquer qu’il a été utilisé pour l’accouplement (bien qu’il puisse être réutilisé si nécessaire). Pour la tenue régulière du stock, installez 6 à 8 flacons pour les femelles productrices et 6 à 8 flacons pour les mères mâles (figure 4). Installez la moitié des flacons avec des mères (ou des pères) à partir d’un flacon adulte et l’autre moitié des nouveaux flacons à l’aide d’un autre flacon adulte afin de minimiser les goulets d’étranglement génétiques.À l’occasion, une erreur de ségrégation produira un mâle exceptionnel dans les flacons de production de femelles. Si une fiole avec des femelles adultes a un mâle exceptionnel, retirez-la et écrasez-la pour tuer ce mâle. Si possible, jetez toutes les femelles de ce flacon et attendez quelques jours jusqu’à ce que d’autres femelles adultes puissent être fermées et utilisées en toute sécurité pour des croisements.REMARQUE : Il est préférable de ne pas utiliser les femelles de ce flacon pour des croisements, car elles peuvent s’être accouplées avec le mâle exceptionnel et ne pas produire un croisement fertile. Une fois que les femelles adultes ont été ajoutées à tous les flacons, répétez les étapes 1.5 à 1.11 pour ajouter deux mâles adultes (figure 4) à chaque flacon contenant déjà des mouches femelles. Tapotez la fiole avec les femelles sur un tampon en caoutchouc afin qu’elles ne s’échappent pas lorsque les deux mâles sont ajoutés séquentiellement.REMARQUE : Travaillez rapidement et n’anesthésiez pas trop les mouches adultes car cela les tuerait. Ajoutez une étiquette à chaque flacon indiquant la souche, le croisement (pour la progéniture femelle ou mâle), si la mère provient du flacon adulte #1 ou #2 et la date de l’accouplement. Entrez également les informations ci-dessus dans un cahier et indiquez le nombre de flacons configurés pour chaque croix.REMARQUE : Il est pratique d’ajouter une serviette en papier pour séparer les flacons produisant des mâles des flacons produisant des femelles dans le plateau. Laissez les flacons tranquilles sur le comptoir pendant ~15 min pour être sûr que les adultes se réveillent et volent. Observez s’ils s’accouplent (très peu de temps après leur réveil) où la femelle et le mâle sont orientés d’arrière à arrière (le fermoir mâle saisira l’ovipositeur pointu de la femelle) (Figure 4, en bas).REMARQUE : Une femelle adulte n’acceptera un mâle adulte qu’une seule fois, alors ne bousculez pas les flacons après l’accouplement car cela pourrait séparer le mâle de la femelle pendant le processus d’accouplement et cette femelle ne se réaccouplera pas. Placez le plateau contenant les flacons accouplés dans l’incubateur (p. ex., 21 °C). Étiquetez le plateau avec le nom du stock (par exemple, HoLo2) et la semaine du cycle de 5 semaines (semaines 1, 2, 3, 4 ou 5).REMARQUE : Conservez le plateau avec les mouches qui viennent d’être accouplées dans une partie séparée de l’incubateur ou d’un autre incubateur pour vous rappeler de ne pas nourrir les flacons avant que les larves n’aient émergé (décrit ci-dessous). 2. Accouplement de masse REMARQUE : En règle générale, une seule mère B. coprophila aura 60 petits dans sa couvée. Lorsqu’un plus grand nombre de descendants est nécessaire pour les expériences, un accouplement de masse peut être effectué au lieu de l’accouplement en une seule paire décrit ci-dessus. L’accouplement de masse peut être effectué dans les flacons en verre standard de 28 cm de diamètre lorsque les mères seront prélevées un jour plus tard pour la ponte induite et le prélèvement d’embryons. Cependant, si un plus grand nombre de larves est nécessaire, l’accouplement de masse se fait dans un bocal avec une plus grande surface pour éviter la surpopulation. Percez plusieurs petits trous dans le couvercle du bocal afin que les larves puissent respirer un peu d’air. Suivez les étapes ci-dessus dans la section 1, mais utilisez des pinces à pointe fine pour déplacer toutes les mères productrices femelles (ou toutes les mères productrices mâles) vers un coin avant du coussin anti-mouches blanc. Utilisez 10 à 15 femelles adultes grasses anesthésiées et balayez ce groupe avec un pinceau dans le flacon ou le bocal avec de petits trous percés dans le couvercle.REMARQUE : Effectuez les étapes 2.1 et 2.2. rapidement pour l’accouplement de masse afin d’éviter une anesthésie excessive qui empêcherait les croisements fertiles. Sélectionnez 20 à 25 mâles adultes gras anesthésiés et déplacez-les avec des pinces à pointe fine vers le coin avant du coussin anti-mouches blanc. Tapotez vigoureusement la fiole ou le bocal avec les femelles sur un tampon en caoutchouc afin qu’elles ne s’échappent pas lorsque le bouchon ou le couvercle est retiré pour balayer le groupe de mâles adultes anesthésiés du coussin anti-mouches blanc à l’aide d’un pinceau. 3. Collecte d’embryons après l’accouplement de masse Un jour (24 h) après l’accouplement, effectuez les étapes 1.5-1.11 pour anesthésier les mouches adultes (mélange de femelles et de mâles) et les transférer dans un coussin anti-mouches blanc.REMARQUE : L’ovogenèse n’est pas encore terminée lorsque les mouches adultes s’accouplent, ce qui déclenche la méiose finale ; Les ovules matures sont fécondés par les spermatozoïdes stockés dans la spermathèque lorsque les ovules sont déchargés 29. L’achèvement de l’ovogenèse peut prendre 1 à 2 jours, c’est pourquoi 1 jour est autorisé après l’accouplement avant que la ponte ne soit induite. À l’aide d’une pince à pointe fine, prenez une femelle adulte par ses ailes et placez-la sur une boîte de Pétri de 100 mm de diamètre contenant 2,2 % (poids/vol) de gélose, avec ses ailes insérées dans la gélose. Répétez cette étape séquentiellement pour chaque femelle adulte sur le coussin anti-mouches blanc. Jetez les mâles adultes sur le tapis anti-mouches. Une fois que toutes les mouches femelles sont empalées sur la gélose, induisez la ponte en pressant doucement la tête avec des pinces jusqu’à ce que la mouche femelle ait des mouvements semblables à des convulsions. Vous pouvez également serrer doucement son thorax. Elle pondra ensuite une grappe d’œufs fécondés dans les 30 à 60 minutes. Couvrez la boîte de Pétri avec son couvercle humidifié avec une lingette de laboratoire imbibée d’eau pour éviter l’attraction électrostatique des œufs sur le couvercle. 4. Vérification de l’éclosion des larves Vérifiez l’éclosion des larves 1 semaine après l’accouplement ; Retirez le bouchon de la fiole et utilisez un microscope à dissection pour détecter la présence de larves. Leur mâchoire noire s’ouvrira et se fermera à plusieurs reprises et ils avanceront lentement. S’il n’y a que quelques larves, écrivez « peu » sur l’étiquette du flacon, pour vous rappeler de moins nourrir ce flacon. Examinez chaque flacon du plateau avec cette croix et entrez le nombre de flacons avec des larves dans le cahier dans une colonne à côté du nombre de flacons qui ont été mis en place lors de cet accouplement.REMARQUE : Les œufs jaune foncé ne se développeront pas. Les œufs blancs sont susceptibles de se développer et 1 jour avant l’émergence des larves, un pigment noir (la future mâchoire) se développera à l’extrémité antérieure de l’œuf. Ne confondez pas la moisissure avec un filament blanc se terminant par une sphère noire à son extrémité pour des larves – la moisissure ne bougera pas, contrairement aux larves qui rampent vers l’avant sur la gélose. Ajoutez un petit peu de paille (une seule fois) à chaque flacon contenant des larves pour contrôler l’excès d’humidité et fournir une cachette de couverture pour les larves. Déplacez le plateau dans l’incubateur (p. ex. à 21 °C) avec les plateaux de larves provenant des croisements d’accouplement des semaines précédentes et commencez à nourrir les flacons avec les larves nouvellement émergées (voir la section ci-dessous sur l’alimentation).REMARQUE : Généralement, les larves seront en grappe près de leur mère morte et elles commenceront à la manger ; On peut supposer que cela transfère la levure de l’intestin de la mère à l’intestin des larves. Vous pouvez commencer à nourrir le jour de l’émergence des larves ou dans les 2 jours qui suivent. ATTENTION : Si l’alimentation est retardée, les larves se mangeront les unes les autres, avec une seule larve de graisse restante par flacon ! Continuez à vérifier les flacons qui n’avaient pas encore de larves pendant 3 jours par semaine. Si aucune larve n’a émergé après 7 à 10 jours, jetez le flacon ou conservez-le pour le laver dans le flacon. 5. Préparation de la nourriture REMARQUE : Tous les ingrédients alimentaires doivent être sans pesticides ! Utilisez une cuillère à soupe pour mesurer les ingrédients suivants en volume et déposez-les dans une casserole en métal ou en verre (par exemple, une plaque de cuisson en métal de 8 pouces x 8 pouces) : 4 parties de paille d’avoine (8 cuillères à soupe), 2 parties de poudre de champignon Shitake (4 cuillères à soupe), 1 partie de poudre d’épinards (2 cuillères à soupe), 1 partie de poudre d’ortie (2 cuillères à soupe). Utilisez la cuillère à soupe pour bien mélanger les ingrédients dans la poêle.REMARQUE : Alternativement, 2 parties de poudre d’épinards ou de poudre d’ortie peuvent être utilisées au lieu de 1 partie de chaque. Couvrir la casserole de papier d’aluminium et l’autoclave à sec pendant 20 à 30 min. Laissez-le refroidir à température ambiante pendant la nuit ou plus. Retirez le papier d’aluminium de la poêle et brisez le mélange d’aliments stérilisés en utilisant un mouvement de broyage avec la cuillère à soupe pour créer un mélange poudreux. Ajouter 1 partie (2 cuillères à soupe bombées) de levure de bière et bien mélanger dans le mélange d’aliments autoclavés.REMARQUE : La levure de bière n’est pas autoclavée car cela tuerait la levure. Transférez le mélange alimentaire dans un bocal stérile bouché.REMARQUE : Le même type de pot de 240 ml que celui utilisé pour l’accouplement de masse peut être utilisé, et la recette ci-dessus remplira le pot. De même, le même type de bocal stérilisé doit être rempli uniquement de paille qui a été autoclavée dans une casserole recouverte de papier d’aluminium. 6. Alimentation REMARQUE : Ajustez la quantité de nourriture donnée en fonction de l’âge et de la quantité de larves. Donnez beaucoup de nourriture dans des bocaux avec de nombreuses larves issues d’un accouplement de masse. Donnez juste une légère pincée de nourriture dans les plaques de Petri avec des larves qui sont stockées pendant quelques jours pour le stade de développement. La méthode d’alimentation décrite ci-dessous a été développée dans le laboratoire de Charles Metz 29, et elle a été utilisée par son laboratoire et par Helen Crouse, Susan Gerbi et d’autres avec succès depuis un siècle. Lavez-vous les mains et rincez-les bien pour enlever le savon.REMARQUE : Les gants ne sont pas recommandés car ils diminuent la sensation de vos doigts pour réguler la quantité de nourriture donnée à chaque flacon. Conservez un bocal stérile bouché avec de la paille moulue et un bocal stérile avec de la nourriture dans l’incubateur (p. ex., 21 °C) où les larves sont conservées. Retirez le couvercle du bocal et versez un peu de nourriture dans un bol propre (par exemple, un plat de bonbons) pour un accès plus facile ; Remettez le couvercle sur le bocal contenant le reste des aliments. Gardez le bol ouvert avec les aliments dans un petit plateau en métal ou en verre ; Cela empêchera les acariens ou autres insectes de ramper sur la paroi du plateau pour entrer dans le bol avec de la nourriture. Ramassez de la nourriture entre le deuxième et le troisième doigt (ou entre le pouce et le deuxième doigt). De l’autre main, retirez un flacon du plateau et retirez le bouchon en le tenant avec les doigts pendant que vous nourrissez. Examinez le flacon pour déterminer l’âge et le nombre de larves et déposez la quantité appropriée de nourriture dans le flacon en tournant les deux doigts qui maintiennent la nourriture l’un contre l’autre. Les flacons avec des larves nouvellement émergées n’ont besoin que de quelques grains de nourriture. Les flacons contenant des larves plus âgées doivent avoir une fine couche de nourriture recouvrant le dessus de l’agar. S’il y a de la moisissure blanche dans le flacon, utilisez de l’éthanol à 70 % pulvérisé sur une lingette de laboratoire pour essuyer une longue sonde métallique (par exemple, avec un manche en bois), retirez le bouchon et insérez la sonde propre dans le flacon pour tapoter le moule à la surface de la gélose. S’il y a beaucoup de moisissure, faites tourner la sonde pour enrouler le moule autour de la sonde afin de la retirer du flacon. Ne pas déranger le sommet de la gélose car des larves y vivent ; Ajoutez juste une petite quantité de nourriture et remettez le bouchon dans le flacon. Essuyez la sonde avec une lingette de laboratoire imbibée d’éthanol à 70 % avant de ranger la sonde ou de l’utiliser pour nettoyer un autre flacon. Une fois que tous les flacons d’un plateau ont été alimentés, replacez le plateau dans l’incubateur et retirez le plateau suivant pour l’alimentation comme à l’étape 6.3. Une fois l’alimentation terminée, versez le reste de la nourriture du bol dans le bocal préalablement stérilisé, fermez le bocal et rangez-le dans l’incubateur. 7. Collecte de larves ou de pupes sur des plaques de Pétri Pour un petit nombre de larves, utilisez une sonde métallique ou une spatule qui a été essuyée avec de l’éthanol à 70 % pour creuser dans la couche supérieure de gélose dans un flacon afin de transférer la gélose adhérente avec quelques larves dans une boîte de Pétri stérile de 100 mm de diamètre à moitié remplie de gélose à 2,2 % (poids/vol). Pour un plus grand nombre de larves, insérez une spatule le long de la paroi au fond du flacon pour retirer le bouchon de gélose du flacon et déposez-le face vers le haut dans une boîte de Pétri vide. À l’aide d’un microscope à dissection, les larves se trouvent au sommet du bouchon de gélose et transférez-les à l’aide d’une pince à pointe fine dans une boîte de Pétri stérile de 100 mm de diamètre à moitié remplie de gélose à 2,2 % (poids/vol). À l’aide d’un microscope à dissection, les larves sont divisées à l’aide d’une pince à pointe fine en groupes du même stade de développement.REMARQUE : En raison d’une légère asynchronie du développement, il y aura plusieurs grappes différentes de larves triées sur la plaque de Pétri avec 2,2 % (poids/vol) de gélose. Ajoutez une petite pincée de nourriture et placez la boîte de Pétri avec les larves dans l’incubateur. Retirez-le quotidiennement pour l’observer avec le microscope de dissection afin de sélectionner le stade de développement souhaité.REMARQUE : Pour les études de gonflement de l’ADN, les larves précoces de l’œil passent par les stades 10×5, 12×6, 14×7 et l’œil de bord/mâchoire tombante avec ~1 jour à chacun de ces stades 30,31. Choisissez des pupes dont les yeux sont 1/4 à 1/2 remplis de pigment pour avoir les stades de méiose I et II dans les testicules nymphaux. 8. Stockage des larves en chambre froide En guise de sauvegarde, conservez dans la chambre froide environ quatre flacons de larves femelles et quatre flacons de larves mâles issus de 2 semaines consécutives de croisements. Pour l’entreposage de secours, nourrissez les larves qui sont au débutdu 4 e stade (stade pré-ocelle) et mettez-les dans un plateau ouvert sur une étagère dans la chambre froide ; Nourrissez ces flacons une fois par mois. Retirez les 16 flacons des 2 semaines consécutives de croisements d’accouplement du froid après 2-3 mois (marquez-le sur un calendrier pour rappel) ; placez-les dans un incubateur (p. ex., 21 °C) pour les nourrir normalement et laissez-les devenir des adultes à utiliser pour les croisements. Lorsque les flacons sont retirés de la chambre froide, placez un nouvel ensemble de flacons avec des larves du 4e stade précoce dans la chambre froide afin que ces flacons soient toujours disponibles comme réserve pour les stocks.REMARQUE : La viabilité après l’entreposage en chambre froide n’a pas été testée systématiquement pour différents stades de développement, mais notre expérience révèle que l’entreposage au froid des larves du 4e stade fonctionne bien. 9. Lavage des flacons Une fois les adultes morts (~2-3 semaines après l’éclosion), retirez les flacons de l’incubateur et placez-les à 60-70 °C pendant 1 heure pour tuer tous les organismes restants. Retirez les bouchons de coton et rangez-les dans une boîte en plastique. À l’aide d’une spatule, grattez le bouchon de gélose du flacon dans une poubelle. Faites tremper les flacons pendant la nuit ou plus longtemps immergés dans l’eau dans une casserole. Utilisez une brosse à éprouvette réservée à cet effet (jamais utilisée pour les récipients contenant des produits chimiques ou du savon) et frottez de haut en bas dans le flacon sous l’eau courante du robinet. Placez le flacon nettoyé, côté ouvert vers le bas, dans un panier en métal. Remplissez le panier de flacons nettoyés.REMARQUE : N’utilisez jamais de savon dans les flacons car tout savon résiduel pourrait tuer B. coprophila. Ajoutez un couvercle en treillis métallique dans le panier, et tout en maintenant le couvercle en place, retournez le panier pour remplir tous les flacons d’eau déminéralisée. Tout en maintenant le couvercle en place, retournez le panier pour vider l’eau déminéralisée des flacons. Répétez les rinçages à l’eau déminéralisée 4 fois. Placez les paniers contenant les flacons nettoyés sur du papier absorbant ou une plate-forme en filet ouvert (p. ex., chariot de laboratoire) pour qu’ils sèchent toute la nuit ou plus longtemps. Conservez les flacons secs dans un tiroir.REMARQUE : Ne laissez pas les flacons contenant des adultes morts rester trop longtemps avant de les laver car cela pourrait inviter une infestation d’acariens. 10. Verser la gélose Remplissez un grand récipient (panier en métal ou plateau en métal) de flacons propres et ajoutez un bouchon de coton à chaque flacon. Réutilisez les bouchons prélevés sur les anciens flacons lorsque les flacons ont été lavés et utilisez les bouchons à plusieurs reprises jusqu’à ce qu’ils se dégradent et se désagrègent et doivent être jetés. Stérilisez le récipient avec les flacons bouchés sur un cycle de séchage pendant ~30 min et laissez-les refroidir à température ambiante pour les stocker dans le récipient de l’autoclave. Gardez toujours à portée de main deux contenants (un en cours d’utilisation et un de rechange) avec des flacons bouchés autoclavés. Placer 11,0 g de poudre de gélose dans un erlenmeyer de 1 L et ajouter 500 ml d’eau distillée pour obtenir une solution de gélose à 2,2 % (poids/vol) suffisante pour verser ~24 flacons (~21 mL/flacon). Faites tourner le ballon et placez-le dans un four à micro-ondes.REMARQUE : À partir de là, utilisez un gant d’autoclave résistant à la chaleur pour manipuler le flacon. La même solution de gélose à 2,2 % (poids/vol) peut être versée dans des plaques de Pétri (pour les larves cueillies) ou des bocaux (pour les accouplements de masse) si ceux-ci sont nécessaires. Passez au micro-ondes pendant 1 min, retirez la fiole pour la faire remuer, replacez-la dans le four à micro-ondes et passez-la à nouveau au micro-ondes pendant 1 min. Répétez cette opération plusieurs fois. Regardez la fiole à travers la porte vitrée du four à micro-ondes. Lorsque la solution de gélose commence à mousser et à bouillir, utilisez immédiatement le bouton d’arrêt manuel. Ne faites pas tourner le ballon à ce stade (il pourrait déborder), retirez-le délicatement du four sur le comptoir et laissez-le reposer quelques minutes. Retirez le bouchon d’un flacon stérilisé et tenez-le d’une main ; Utilisez l’autre main pour verser une gélose à 2,2 % de ~2,5 cm de haut dans le flacon stérilisé. Ensuite, replacez le bouchon dans le flacon. Répétez cette opération jusqu’à ce que toute la gélose ait été versée.REMARQUE : Si trop peu de gélose est versée dans le flacon, il sèchera plus rapidement pendant l’utilisation et se détachera des parois du flacon. Si une trop grande quantité de gélose est versée dans le flacon, il est difficile de se concentrer sur la couche supérieure lors de l’évaluation de l’éclosion des larves avec un microscope à dissection. Laissez les flacons versés rester sur le comptoir à température ambiante pendant 1 à 2 jours afin que la gélose durcisse et que l’humidité s’évapore complètement. Utilisez les flacons pour les croisements d’accouplement ou rangez-les couchés sur le côté dans une boîte en plastique avec un couvercle hermétique ; Placez une serviette en papier imbibée d’eau sur les flacons avant de placer le couvercle sur la boîte (cela empêchera la gélose de se dessécher et de se détacher de la paroi du flacon). Conservez la boîte avec les flacons versés à température ambiante pendant quelques jours ou dans un réfrigérateur à 4 °C ou une chambre froide jusqu’à 2 semaines. Avant d’utiliser les flacons conservés, retirez-les de la boîte et laissez-les sur le comptoir à température ambiante pendant une heure ou deux pour laisser la condensation s’évaporer de l’intérieur des flacons (les mouches adultes colleraient au condensat et se noieraient). 11. Fabrication de bouchons pour flacons Placez un flacon propre dans un support de tube à essai de 50 ml en polystyrène (forcez le tube pour qu’il se tienne droit). Découpez un carré d’étamine (2 à 4 couches d’épaisseur) et placez-le sur le dessus du flacon. Placez des restes d’étamine de bouchons précédemment fabriqués sur l’étamine pour créer une couche plus épaisse. Placez du coton sur l’étamine et appuyez sur dans le flacon, en vous assurant de bien remplir le pouce supérieur du flacon. Tenez le haut des extrémités de l’étamine ensemble et attachez-la avec de la ficelle. Coupez l’excédent de ficelle et l’excédent d’étamine (laissez suffisamment de queues de la ficelle pour la maintenir attachée et suffisamment d’étamine pour saisir confortablement le bouchon).REMARQUE : Ajustez les bouchons de manière à ce qu’ils soient bien ajustés. Vous devriez être capable de les retirer avec votre index et votre index tout en les tenant d’une main. Si vous ramassez le flacon par le bouchon et qu’il tombe, il est trop lâche. S’il émet un fort bruit de claquement lorsqu’il est retiré, il est peut-être trop serré. S’il est trop serré ou si le bouchon est recouvert d’une couche de gélose dure et sèche, les mouches peuvent suffoquer. Si le bouchon est un peu trop lâche ou glisse sur les côtés du flacon, il peut être tapoté sur le comptoir pour l’écraser dans une taille légèrement plus grande. 12. Horaire hebdomadaire typique (pour une plus grande efficacité, effectuez les tâches dans l’ordre indiqué) Lundi (~30 min)Nourrir les flacons avec des larves. Verser la gélose dans des flacons stériles et propres munis de bouchons. Mercredi (~2 h)Placez les flacons contenant des adultes morts dans un four pendant 1 h et conservez-les pour les laver. Vérifiez la présence de larves « baby-hatch ». Nourrir les flacons avec des larves. Effectuez des croisements d’accouplement hebdomadaires. Autres tâches au besoin : nettoyer les flacons en autoclave avec des bouchons pour avoir une réserve d’approvisionnement au besoin ; faire de la nouvelle nourriture et de la paille autoclave au besoin ; bocaux autoclave au besoin pour la nourriture et la paille. Vendredi (~30 min)Vérifiez la présence de larves « baby-hatch ». Nourrir les flacons avec des larves.

Representative Results

Les protocoles décrits ici ont permis d’élever B. coprophila. Lorsque des adultes gras récemment enfermés sont choisis pour l’accouplement (figure 4), plus de 90 % des croisements peuvent être fertiles et donner une progéniture. Le succès de la fécondité varie selon les souches (tableau 2). La crosse 7298 (chromosome X avec marqueur ondulé) était la plus saine des actions, mais a traversé une période de déclin, apparemment en raison de l’activation d’éléments mobiles de l’ADN créant des réarrangements du génome32. Le stock HoLo2 représente une souche saine dérivée de 7298, où apparemment les réarrangements du génome se sont stabilisés, et il a remplacé le stock parental 7298 au centre du stock. La souche HoLo2 est celle qui a été utilisée pour séquencer le génome de B. coprophila et est celle qui est la plus largement utilisée par divers groupes de laboratoire. Récemment, la mutagenèse CRISPR des mouches HoLo2 a été utilisée pour créer le stock W14 avec un phénotype d’œil blanc à utiliser pour la transformation avec des marqueurs oculaires fluorescents (Yamamoto et Gerbi, données non présentées). La souche W14 est exceptionnellement robuste. La crosse 6980 (marqueurs d’aile ondulée et de veine gonflée) est un peu moins robuste et la crosse 91S (marqueur d’aile petite) est encore moins robuste. Les croisements réussis donnent naissance à des embryons (figure 5). Les embryons subissent l’élimination des chromosomes X paternels imprimés au niveau de la division de clivage entre le 7e et le 9e . De plus, les chromosomes L limités à la lignée germinale sont éliminés de la lignée somatique chez les embryons à la 5e à la 6e division de clivage. Les embryons émergent sous forme de larves, qu’il ne faut pas confondre avec les moisissures qui peuvent également être présentes (Figure 6). Les ocelles (de l’œil de l’adulte) apparaissent dans la seconde moitié du 4e stade larvaire (figure 7). La taille des ocelles fournit un marqueur phénotypique pratique pour le début et la progression de l’amplification de l’ADN par bouffée d’ADN, qui est l’un des deux seuls exemples connus d’amplification intrachromosomique de l’ADN (gène) naturellement régulée par le développement. Par la suite, des pupes se développent, et la quantité de pigment remplissant leurs yeux peut servir de marqueur de développement pour la méiose I et II dans la spermatogenèse (Figure 8) avec ses comportements chromosomiques uniques dans ces divisions. Figure 4 : Accouplement de mouches B. coprophila adultes. Le panneau supérieur montre les trois types de mouches adultes du stock HoLo2 : les mères productrices de femelles aux ailes ondulées (femelles adultes X’WX), les mères productrices mâles aux ailes droites (XX femelles adultes) et les mâles aux ailes droites (X0 mâles adultes). Notez l’ovipositeur pointu à l’extrémité postérieure des mouches femelles et le fermoir en forme de crochet à l’extrémité postérieure des mouches mâles. Le panneau inférieur montre un mâle et une femelle en train de s’accoupler, où le mâle a attrapé l’ovipositeur de la femelle. Le sperme sera stocké dans la spermathèque de la femelle et fécondera les ovules au fur et à mesure qu’ils seront déchargés vers l’extérieur. La longueur des adultes est de 2,0 mm (mâles), 2,5 mm (femelles). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Embryons de B. coprophila. Le panneau supérieur gauche est une vue d’embryons à l’aide d’une lumière standard dans un microscope à dissection ; Les noyaux du cytoplasme syncytial apparaissent sous forme de points noirs. Le panneau de droite utilise la microscopie à fluorescence pour visualiser les noyaux d’embryons colorés à l’iodure de propidium. Les embryons ont une longueur moyenne de 200 microns et une largeur moyenne de 150 microns. Les noyaux des cellules germinales se regroupent au pôle postérieur de l’embryon, comme on le voit pour les cycles 6 (embryon incliné vers l’avant) et 7-9, après quoi ils sont entrecoupés de noyaux somatiques. L’élimination du chromosome L dans la lignée somatique se produit dans la division de clivage 5 ou 6 ; L’élimination du chromosome X dans la lignée somatique se produit dans la 7e, 8e ou 9e divisionde clivage. La cellularisation se produit pendant l’interphase du cycle 11. Le tableau de gauche indique la durée moyenne de chaque cycle de division à 22 °C. La table de gauche et le panneau de droite sont adaptés avec la permission de de Saint Phalle et Sullivan35. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Les embryons de B. coprophila émergent sous forme de larves. Une grappe d’embryons (flèche épaisse bleue) est visible près de l’ovipositeur de la femelle adulte morte après la ponte. Une semaine après la ponte, les embryons deviennent de jeunes larves, dont plusieurs sont indiquées par des flèches noires. Les larves nouvellement émergées ont une mâchoire noire à l’extrémité antérieure et un corps translucide. Ils se déplacent sur la surface de la gélose et ne doivent pas être confondus avec de la moisissure qui ne bouge pas. L’encart montre un peu de moisissure, avec un filament blanc (flèche rouge) et une spore noire à son extrémité (flèche verte), et est très légèrement plus petit que les larves nouvellement émergées. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Stades oculaires des larves de B. coprophila. Les taches oculaires se forment à l’avant de la larve, juste derrière la mâchoire, et sont composées de granules de pigment dont le nombre augmente. Les ocelles sont l’anlage de l’œil adulte. Le panneau supérieur montre des larves qui ont été visualisées avec un microscope de dissection ; Le panneau inférieur est une vue agrandie des taches oculaires à l’aide d’un microscope à contraste de phase pour visualiser une larve sur une lame de microscope avec une goutte d’eau distillée et une lamelle flottant légèrement sur le dessus. La nomenclature des stades du sangle oculaire est conforme à Gabrusewycz-Garcia30 où le nombre de granules est compté dans la rangée la plus longue (par exemple, 12) et le nombre de rangées supplémentaires à l’exclusion de la rangée la plus longue est noté (par exemple, 6 pour le stade du point oculaire 12×6). L’initiation de l’amplification de l’ADN spécifique au site dans les chromosomes polytènes des glandes salivaires commence au stade 10×5 et se termine au stade 14×7 lorsqu’il y a une rafale de transcription au locus et une expansion des bouffées d’ADN31. Au stade suivant de l’œil de bord/mâchoire tombante, les granules de l’œil commencent à fusionner et s’éloignent latéralement de la ligne médiane ; La longueur du corps larvaire se raccourcit. De plus, les bouffées d’ADN se condensent à ce stade. Il faut environ une journée à 21 °C pour traverser chaque stade du point oculaire. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 8 : Développement des pupes de B. copropila. Au cours de la nymphose, tous les tissus larvaires s’histolysent à l’exception du système nerveux et sont remplacés par des tissus adultes qui apparaissent par divisions cellulaires des disques imaginaux. La couleur du corps passe du blanc au beige au brun au noir. Le pigment remplit progressivement l’œil de la nymphe ; Les méioses I et II se produisent dans les pupes mâles dont les yeux sont remplis de pigment36. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Nom de l’action Marqueurs Taux de fécondité Commentaires 7298 Aile ondulée (W) ~75 % HoLo2 Aile ondulée (W) ~90 % dérivé de 7298 W14 Aile ondulée (W) ; Yeux blancs ~95 % dérivé de HoLo2 6980 Aile ondulée (W) ; veines enflées (SW) ~65 % LES 91S aile ondulée (W) faible ; Petites (P) Ailes ~50 % le marqueur ondulé a été introduit dans une croix pour sauver 91S Tableau 2 : Stocks de Bradysia (Sciara) coprophila. Le tableau 1 de Gerbi6 énumère ces marqueurs et d’autres qui n’existent plus. Cinq translocations (T1, T23, T29, T32, T70) à l’extrémité centromère du X27 sont résumées dans la figure 8 de Gerbi6 mais n’existent plus. Dossier supplémentaire 1 : Croisements HoLo2 (et 7298 et W14), Croisement 91S et sauvetage, Croisement 6980, Croisements de translocation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les protocoles présentés ici pour l’élevage de B. coprophila seront utiles aux scientifiques qui souhaitent élever cet organisme dans leurs laboratoires pour des expériences visant à approfondir ses caractéristiques biologiques uniques. La description initiale de la méthode d’alimentation à l’aide de levures et de poudre de champignons saupoudrées sur une base de gélose pour maintenir B. coprophila²⁹ a été utilisée au laboratoire de Metz pour élever 14 espèces différentes de mouches Sciarides⁵. Par la suite, il a été observé que l’ajout de poudre d’ortie et/ou d’épinards augmentait encore la vitalité de B. coprophila (Gabrusewycz-Garcia, communication personnelle). Ces méthodes ont permis de maintenir des espèces apparentées de la famille des Sciaridae, notamment Bradysia impatiens et Lycoriella ingenua qui sont actuellement en culture (Robert Baird, communication personnelle).

D’autres méthodes (telles que les méthodes d’alimentation alternatives décrites ci-dessous) ont été essayées pour élever B. coprophila, mais les protocoles décrits ici ont été optimisés pour avoir le rapport le plus favorable de larves par surface de gélose afin d’obtenir les adultes gras les plus fertiles et de minimiser la croissance de moisissures. Pour passer à l’échelle, l’accouplement de masse peut être effectué dans des flacons en verre, comme décrit dans le protocole 2 ci-dessus. Alternativement, quelques (2-4) femelles adultes peuvent être placées ensemble avec deux fois plus de mâles adultes dans un flacon tel que celui utilisé pour élever la drosophile (bouteille jetable de 6 oz = 177,4 ml en polypropylène Drosophila à fond carré). Dans les deux cas, le chercheur doit être pleinement convaincu que le flacon ne contient que toutes les mères productrices ou toutes les mères productrices mâles.

Ne nourrissez que les larves car les pupes et les adultes ne mangent pas. Ne donnez pas le flacon si les larves se sont transformées en pupes (un signe de cela est lorsque les premières mouches adultes à émerger tôt apparaissent). Une fois que les adultes sont fermés, placez les flacons dans un incubateur plus froid (p. ex. 16 °C) s’il y en a, car cela permettra aux adultes de vivre plus longtemps. Nourrissez les larves trois fois par semaine (p. ex., lundi, mercredi et vendredi), en augmentant la quantité de nourriture donnée par flacon à mesure que les larves vieillissent. Nourrissez généreusement et vous serez récompensé par des adultes gras et fertiles. Cependant, si vous donnez trop, de la moisissure blanche apparaîtra et c’est un signe qu’il faut réduire la quantité de nourriture que vous déposez dans un flacon. De plus, si vous nourrissez trop, un épais tampon de nourriture se développera sur le dessus de la gélose et rendra plus difficile l’émergence des adultes (vous pouvez retirer le tampon avec une pince, mais veillez à ne pas retirer les larves avec le tampon – il est préférable de ne pas avoir à le faire du tout). Les flacons contenant peu de larves (marqués « peu ») ont besoin de moins de nourriture. Si vous nourrissez trop peu, les larves grimperont sur les parois de la fiole à la recherche de nourriture. Les larves sous-alimentées donnent de petits adultes moins fertiles.

Méthodes d’alimentation alternatives
Diverses méthodes ont été tentées pour nourrir les larves une seule fois au stade larvaire plutôt que 3 fois par semaine. B. coprophila ne se développera pas sur des aliments de type drosophile . John Urban (communication personnelle) a essayé de mélanger de la nourriture de B. coprophila avec l’agar, mais trop de moisissure s’est développée. Il a découvert que l’ajout de deux inhibiteurs de moisissure (tégosept et acide propionique) en combinaison et séparément, en essayant plusieurs concentrations différentes, était tous toxiques pour B. coprophila à des niveaux qui inhibent la moisissure. La gélose doit avoir un pH de 6-7 (neutre) car B. coprophila tombe malade à un pH acide (comme avec l’acide propianique). Alternativement, pour éviter de se nourrir trois fois par semaine, il a essayé d’utiliser une spatule ou une seringue sans aiguille pour distribuer une pâte de levure épaisse (levure sèche active Red Star mélangée à un peu d’eau distillée pour l’humidifier) comme une cuillerée sur la gélose dans chaque flacon une semaine après l’accouplement (c’est-à-dire à peu près au moment où les larves commenceront à émerger).

Une autre méthode pour éviter de nourrir trois fois par semaine consiste à ajouter une culture vivante de champignons à chaque flacon. Bath et Sponsler³⁷ ont rapporté qu’une surface de gélose oblique avec du milieu de Sabouraud devrait être striée d’une culture fongique des genres Chaetoconidia (le meilleur) ou bien Baplosporangia ou Xllescheria. Le champignon a été cultivé de plusieurs jours à une semaine avant l’introduction de B. coprophilara . Aucune alimentation n’a été nécessaire après cela. Une variante de cette méthode a également été employée par Ellen Rasch (communication personnelle). Dans nos mains, les flacons étaient trop humides avec cette méthode et les larves se sont noyées, mais elle a pu être réessayée pour optimiser le nombre de larves par rapport aux flacons avec des champignons vivants.

Arthur Forer (communication personnelle) a eu un certain succès dans l’élevage de B. coprophila de la même manière que les tipules³⁸. Avec cette approche, les pupes ont été élevées sur du papier mâché humide. Par la suite, les adultes ont été accouplés et les œufs ont été déposés sur du papier mâché frais et humide. Les larves résultantes ont été conservées sur du papier mâché dans des boîtes de Pétri et nourries avec des feuilles d’ortie en poudre deux fois par semaine. Les pupes ont été placées dans une cage pour répéter le cycle.

Yukiko Yamashita (communication personnelle) a essayé sans succès d’élever B. coprophila sur le sol, imitant les conditions où ils se trouvent dans la nature dans les plantes en pot et les serres à forte humidité. Cependant, la moisissure peut devenir un problème lorsque le taux d’humidité est élevé. Néanmoins, un sol humide a été utilisé avec succès pour élever des larves de Pseudolycoriella (anciennement Bradysia) hygida dans des boîtes en plastique avec un sol humide ; ils sont nourris avec des feuilles d’Ilex paraguariensis décomposées, complétées à la fin de la vie larvaire avec 1,2% d’extrait de levure, 1,4% d’amidon de maïs, 0,8% de farine d’avoine, 1,2% d’agar¹². De même, le sol humide peut être remplacé par de la mousse de tourbe humide avec des haricots rouges broyés pour élever des mouches Sciarides^39,40.

D’autres méthodes encore ont été employées pour maintenir les cultures de Bradysia en laboratoire : (i) pomme de terre autoclave à laquelle on ajoute de la levure et de l’engrais pour sang séché⁴¹ ; ii) fumier⁴²^, ⁴³^, ⁴⁴ auquel on peut ajouter du sang séché⁴⁵ ; iii) récipients en plastique avec des cotons et des essuie-tout humides avec du soja moulu⁴⁶.

Acariens
Les acariens peuvent être transférés de la drosophile à B. coprophila. Pour minimiser cela, il est préférable de garder B. coprophila dans un incubateur ou une pièce séparés, pas à proximité des stocks de drosophiles . De plus, effectuez tout travail d’entretien de B. coprophila tôt dans la journée avant de manipuler la drosophile. Les acariens peuvent également être transférés à B. coprophila à partir de plantes d’intérieur, alors ne gardez pas les plantes dans la même pièce que B. coprophila. Si les acariens envahissent les flacons, ils peuvent être vus comme de petits organismes sphériques blancs rampant sur le corps de B. coprophila. Les traitements chimiques qui détruisent les acariens chez la drosophile ne peuvent pas être utilisés pour B. coprophila car les produits chimiques tuent B. coprophila (B. coprophila est également sensible aux vapeurs organiques telles que le phénol). Le seul traitement pour débarrasser les stocks d’acariens de B. coprophila consiste à recueillir manuellement les embryons sur une plaque de gélose, à examiner chacun d’eux pour s’assurer qu’il n’y en a pas, puis à les transférer dans des flacons de gélose fraîche à l’aide d’un pinceau fin. Les bouchons de gaze remplis de coton et les flacons en mousse d’acétate de cellulose (comme ceux utilisés pour les flacons en polypropylène de drosophile ) aident tous deux à empêcher l’entrée d’acariens dans les flacons.

Utilité des protocoles d’élevage
Les protocoles décrits ici permettront à la communauté croissante de scientifiques d’élever B. coprophila en tant qu’organisme modèle nouveau/ancien afin d’étudier ses caractéristiques biologiques uniques. De nouveaux groupes de laboratoire sont encouragés à se joindre à la communauté croissante pour maintenir et étudier les caractéristiques biologiques uniques de Bradysia (Sciara).

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions tout particulièrement les anciens gardiens de B. coprophila (Jacob E. Bliss, Paula Bonazinga, Anne W. Kerrebrock, Ingrid M. Mercer, Heidi S. Smith) et le personnel de recherche (en particulier Robert Baird, Michael S. Foulk, Donna Kubai, John M. Urban, Yutaka Yamamoto) pour avoir peaufiné les protocoles d’élevage. Les premières instructions sur les soins à donner à B. coprophila ont été fournies par Helen V. Crouse, Natalia Gabrusewycz-Garcia, Reba M. Goodman, Charles W. Metz et Ellen Rasch. Avec gratitude à Yukiko Yamashita et Anne W. Kerrebrock pour avoir pris en charge le centre boursier Bradysia (Sciara). Nous remercions les personnes suivantes pour leur préparation utile des figures : Brian Wiegmann (figure 1), John M. Urban (figure 4 , panneau supérieur), Laura Ross (figure 4 , panneau inférieur), Yutaka Yamamoto (figure 5 , panneau gauche), Leo Kadota (figure 7 et figure 8). Un grand merci à Ava Filiss et au laboratoire multidisciplinaire de l’Université Brown pour leur aide en matière de photographie et de tournage. Merci à Robert Baird pour ses commentaires sur ce manuscrit. Nos recherches et notre entretien de B. coprophila ont été soutenus par les NIH et la NSF, y compris le soutien le plus récent des NIH GM121455 à S.A.G. De plus amples détails sur B. coprophila sont disponibles sur les sites Web du Centre de stockage Bradysia (Sciara) (https://sites.brown.edu/sciara/ et https://sciara.wi.mit.edu) qui sont actuellement en cours de construction.

Materials

Agar (bacteriological)	U.S. Biological	A0930	https://www.usbio.net;
CO₂ FlyStuff Foot Pedal	Genesee Scientific	59-121
CO2 FlyStuff Blowgun	Genesee Scientific	54-104
CO2 FlyStuff UltimaterFlypad	Genesee Scientific	59-172	https://www.geneseesci.com
Ether fume hood	Labconco	3955220	Sits on top of lab bench
			Filter replacement cat # 6961300
Food: Brewer’s Yeast Powder	Solgar		Obtain from Amazon or health food store
			https://www.solgar.com;
Food: Nettle Powder (pesticide free)	Starwest Botanicals	209460-51
Food: Shitake Mushrooms (pesticide free)	Starwest Botanicals	202127-5	https://www.starwest-botanicals.com;
Food: Spinach Powder ( pesticide free)	Starwest Botanicals	209583-5
Food: Straw (pesticide free )	Starwest Botanicals	209465-3
Jar: clear glass, polypropylene lid	Fisher Scientific:	FB02911765	73 mm dia, 89 mm ht (240 ml) https://www.fishersci.com;
Needle Probe, wooden handle	US Geo Supply Inc	SKU: 4190	5.75” long probe, stainless steel needle https://usgeosupply.com; (970)-434-3708
Vials: glass, preferred:	Wilmad LabGlass
Wilmad-glass custom vials			28-33 mm inner dia, 33 mm outer dia, 9.5 cm ht Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com
Vials: glass (cheaper and ok)	Fisher Scientific	03-339-26H	29 mm outer dia, 9.5 cm h https://www.fishersci.com;
Vials: glass (a bit narrow)	Genesee Scientific	32-201	24.5 mm outer dia,9.5 cm h thttps://www.geneseesci.com
Vials: polypropylene	Genesee Scientific	32-114	28.5 mm outer dia,9.5 cm ht
Vial Plugs
roll of non-absorbent cotton	Fisher Scientific	22-456881
cheesecloth	Fisher Scientific	22-055053	https://www.fishersci.com;

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Gerbi, S. A. Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly Bradysia (Sciara) coprophila: A New/Old Emerging Model Organism. J. Vis. Exp. (206), e66751, doi:10.3791/66751 (2024).