Summary

Paradigmen für die Verhaltensbewertung im Drosophila-Modell der Autismus-Spektrum-Störung

Published: September 06, 2024
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Summary

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) ist mit einer Beeinträchtigung des sozialen und kommunikativen Verhaltens und dem Auftreten von sich wiederholendem Verhalten verbunden. Um die Wechselbeziehung zwischen ASD-Genen und Verhaltensdefiziten im Drosophila-Modell zu untersuchen, werden in dieser Arbeit fünf Verhaltensparadigmen zur Untersuchung von sozialem Abstand, Aggression, Balz, Pflege und Gewöhnungsverhalten beschrieben.

Abstract

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) umfasst eine heterogene Gruppe von neurologischen Entwicklungsstörungen mit häufigen Verhaltenssymptomen, darunter Defizite in der sozialen Interaktion und Kommunikationsfähigkeit, verstärkte eingeschränkte oder sich wiederholende Verhaltensweisen und in einigen Fällen auch Lernbehinderung und motorisches Defizit. Drosophila diente als beispielloser Modellorganismus für die Modellierung einer großen Anzahl menschlicher Krankheiten. Da viele Gene mit ASS in Verbindung gebracht wurden, haben sich Fruchtfliegen als leistungsstarke und effiziente Methode erwiesen, um die Gene zu testen, die angeblich an der Störung beteiligt sind. Da Hunderte von Genen mit unterschiedlichen funktionellen Rollen an ASD beteiligt sind, ist ein einzelnes genetisches Fliegenmodell von ASD nicht möglich; Stattdessen sind einzelne genetische Mutanten, Gen-Knockdowns oder Überexpressions-basierte Studien der Fliegenhomologe von ASD-assoziierten Genen die üblichen Mittel, um Einblicke in die molekularen Signalwege zu gewinnen, die diesen Genprodukten zugrunde liegen. In Drosophila gibt es eine Vielzahl von Verhaltenstechniken, die ein leichtes Auslesen von Defiziten in bestimmten Verhaltenskomponenten ermöglichen. Es hat sich gezeigt, dass der Assay des Sozialraums sowie Aggressions- und Balztests bei Fliegen nützlich sind, um Defekte in der sozialen Interaktion oder Kommunikation zu beurteilen. Das Fellpflegeverhalten bei Fliegen ist eine hervorragende Lektüre für sich wiederholendes Verhalten. Der Gewöhnungsassay wird bei Fliegen verwendet, um die Fähigkeit zum Gewöhnungslernen abzuschätzen, die bei einigen ASD-Patienten beeinträchtigt ist. Eine Kombination dieser Verhaltensparadigmen kann verwendet werden, um eine gründliche Beurteilung des menschlichen ASD-ähnlichen Krankheitszustands bei Fliegen vorzunehmen. Unter Verwendung von Fmr1-mutierten Fliegen, der Rekapitulation des Fragile-X-Syndroms beim Menschen und des POGZ-homologen Row-Knockdowns in Fliegenneuronen haben wir quantifizierbare Defizite in den Bereichen Social spacing, Aggression, Balzverhalten, Pflegeverhalten und Gewöhnung gezeigt. Diese Verhaltensparadigmen werden hier in ihrer einfachsten und unkompliziertesten Form demonstriert, mit der Annahme, dass dies ihre breite Verwendung für die Forschung zu ASS und anderen neurologischen Entwicklungsstörungen in Fliegenmodellen erleichtern würde.

Introduction

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) umfasst eine heterogene Gruppe von neurologischen Störungen. Sie umfasst eine Reihe komplexer neurologischer Entwicklungsstörungen, die durch multikontextuelle und anhaltende Defizite in der sozialen Kommunikation und sozialen Interaktion sowie durch das Vorhandensein von eingeschränkten, sich wiederholenden Verhaltens- und Aktivitätsmustern und -interessen gekennzeichnetsind 1. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) wird weltweit bei 1 von 100 Kindern ASS diagnostiziert, wobei das Verhältnis von Männern zu Frauen bei 4,22 liegt. Die Erkrankung macht sich im zweiten oder dritten Lebensjahr bemerkbar. ASD-Kinder zeigen ein mangelndes Interesse an sozial-emotionaler Reziprozität, nonverbaler Kommunikation und Beziehungsfähigkeit. Sie zeigen sich wiederholende Verhaltensweisen wie stereotype motorische Bewegungen, unflexible und ritualisierte Routinebefolgung und intensive Konzentration auf eingeschränkte Interessen. ASD-Kinder zeigen ein hohes Maß an Reaktion auf Berührung, Geruch, Geräusche und Geschmack, während die Schmerz- und Temperaturreaktion vergleichsweise gering ist1. Die Penetranz dieser Störung ist auch bei verschiedenen Patienten, die an ASS leiden, unterschiedlich und daher nimmt die Variabilität zu.

Die derzeitige klinische Diagnose von ASD basiert auf der Verhaltensbewertung der Personen, da es keinen bestätigenden, auf Biomarkern basierenden oder gemeinsamen genetischen Test gibt, der alle Formen von ASDabdeckt 3. Die Entschlüsselung der genetischen und neurophysiologischen Grundlagen wäre hilfreich, um Behandlungsstrategien zu entwickeln. In den letzten zehn Jahren hat eine große Anzahl von Forschungsarbeiten zur Identifizierung von Hunderten von Genen geführt, die entweder gelöscht oder mutiert sind oder deren Expressionsniveaus bei ASD-Patienten verändert sind. Die laufende Forschung konzentriert sich auf die Validierung des Beitrags dieser Kandidatengene anhand von Modellorganismen wie der Maus oder Fruchtfliege, bei denen diese Gene ausgeschaltet oder ausgeschaltet werden, gefolgt von Tests auf ASD-ähnliche Verhaltensdefizite und der Aufklärung der zugrunde liegenden genetischen und molekularen Signalwege, die die Anomalien verursachen. Ein Mausmodell, das Kopienzahlvariationen (CNVs) in den humanen Chromosomenloci 16p11.2 rekapituliert, zeigt einige der ASD-Verhaltensdefekte 4,5,6. Die pränatale Exposition gegenüber einem teratogenen Medikament, Valproinsäure (VPA), ist ein weiteres Mausmodell, das Merkmale aufweist, die der menschlichen ASDähneln 7,8. Darüber hinaus gibt es eine Reihe von Mausmodellen, die genetischen Syndrom-assoziierten Autismus aufweisen, z. B. syndromale Einzelgenmodelle, die durch Mutationen in Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c verursacht werden, und nicht-syndromale Einzelgenmodelle, die durch Mutationen in Genen wie Cntnap2, Shank, Neurexin oder Neuroligin-Genen verursacht werden5.

Die Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) ist ein weiterer prominenter Modellorganismus für die Untersuchung der zellulären, molekularen und genetischen Grundlagen einer Vielzahl von menschlichen Erkrankungen9, einschließlich ASD. Drosophila und Mensch teilen hochkonservierte biologische Prozesse auf molekularer, zellulärer und synaptischer Ebene. Fruchtfliegen wurden erfolgreich in ASD-Studieneingesetzt 10,11,12 um Gene zu charakterisieren, die mit ASDs in Verbindung stehen, und ihre genaue Rolle bei der Synaptogenese, der synaptischen Funktion und Plastizität, dem Aufbau neuronaler Schaltkreise und der Reifung zu entschlüsseln; Es wurde festgestellt, dass Fliegenhomologe von ASD-assoziierten Genen eine Rolle bei der Regulation von sozialem und/oder repetitivem Verhalten spielen 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Die Fruchtfliege hat auch als Modell für das Screening von ASD-Genen und deren Varianten gedient 15,22,23. Die größte Herausforderung in der ASD-Forschung an Fliegen besteht darin, dass es im Gegensatz zu anderen Krankheitsmodellen kein einzelnes ASD-Fliegenmodell gibt. Um die Auswirkungen von Mutationen oder dem Ausschalten eines bestimmten ASD-Gens zu verstehen, muss ein Forscher validieren, ob die Verhaltensphänotypen die Symptome von ASD-Patienten ausreichend nachahmen, und dann dazu übergehen, die molekularen oder physiologischen Grundlagen der Phänotypen zu verstehen.

Daher ist der Nachweis von ASD-ähnlichen Phänotypen für die ASD-Forschung im Fliegenmodell von entscheidender Bedeutung. Im Laufe der Jahre ist eine Handvoll Verhaltenstechniken entstanden, die es uns ermöglichen, Anomalien wie Defizite im Sozialverhalten/in der Interaktion, in der Kommunikation, in sich wiederholenden Verhaltensweisen und in der Reaktionsfähigkeit auf Reize zu erkennen. Darüber hinaus wurden in verschiedenen Labors verschiedene Modifikationen und Upgrades dieser Verhaltenstechniken vorgenommen, um spezifischen Anforderungen wie Upscaling, Automatisierung von Assays, Auslesungen, Quantifizierungs- und Vergleichsmethoden gerecht zu werden. In diesem Videoartikel werden die grundlegendsten Versionen von fünf Verhaltensparadigmen demonstriert, die in Kombination verwendet werden können, um ASS-ähnliche Verhaltensergebnisse auf einfachste Weise zu erkennen.

Aggression ist ein evolutionär konserviertes angeborenes Verhalten, das das Überleben und die Fortpflanzung beeinflusst24. Aggressives Verhalten gegenüber Artgenossen wird sowohl durch die “Motivation zur Sozialisation”25,26 als auch durch die “Kommunikation”27 beeinflusst, die beide bei ASS-Betroffenen beeinträchtigt sind. Aggressives Verhalten ist bei Drosophila gut beschrieben und seine Quantifizierbarkeit durch den robusten Aggressionsassay 28,29,30 und eine gut verstandene genetische und neurobiologische Basis 31 macht es zu einem geeigneten Verhaltensparadigma32 für die Beurteilung des ASD-Phänotyps in einem Fliegenmodell. Aggression wird durch soziale Isolation abseits eines sozialen Umfelds beeinflusst, was zu verstärkter Aggression führt; Das Gleiche wurde beobachtet, wenn männliche Fliegen einige Tage lang isoliert gehalten wurden33,34. Ein weiterer Verhaltensassay, der die Geselligkeit bei Fliegen quantifiziert, ist der Social Space Assay35, der die Entfernungen zwischen den nächsten Nachbarn und die Abstände zwischen den Fliegen in einer kleinen Gruppe von Fliegen misst, wodurch er sich perfekt zum Testen der Rollen von ASD-Gen-Orthologen in Fliegen 12,21,36,37 sowie umweltinduzierten ASD-Fliegenmodellen38 eignet. 39. Urheberrecht

Der Drosophila-Balztest ist ein weiteres Verhaltensparadigma, das häufig verwendet wird, um Veränderungen in sozialen und kommunikativen Fähigkeiten durch Schaltkreis- oder Genmanipulation zu testen, einschließlich Autismus-bezogener Gene 18,19,21,40. Sich wiederholende Verhaltensmuster sind bei ASD-Patienten weit verbreitet, was sich bei Fliegen durch Pflegeverhalten widerspiegelt – eine Reihe von unterschiedlichen, stereotypen Handlungen, die zum Reinigen und zu anderen Zwecken ausgeführt werden. Es wurde erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen von ASD-Genmutationen bei Fliegen21,41 sowie die Exposition gegenüber Chemikalien38,39 zu untersuchen. Mehrere Fortschritte und Automatisierungen im Assay wurden bereits vor 16,41,42,43 beschrieben; Hier demonstrieren wir das grundlegendste Assay-Muster, das einfach zu übernehmen und zu quantifizieren ist.

Es ist bekannt, dass ASD die Gewöhnungsfähigkeit, das Lernen und das Gedächtnis bei einigen Patientenbeeinflusst 44,45,46,47,48,49,50, ASD-Modellorganismen 51,52 und auch Defizite in verschiedenen Geruchsverhaltensweisen verursacht50. Die Gewöhnung an Drosophila-Light-Off-Sprünge wurde zuvor verwendet, um nach ASD-Genenzu suchen 23. Die Gewöhnung kann durch ein einfaches Verfahren des olfaktorischen Gewöhnungsassays 53,54,55 bestimmt werden. Wir beschreiben das Verfahren zur Induktion der olfaktorischen Gewöhnung und testen das Ergebnis unter Verwendung eines klassischen Y-Labyrinth-basierten binären Odor-Choice-Assays56, der zur Erkennung von Defekten in der Gewöhnungsstörung bei ASD-Genmutanten oder Gen-Knockdown-Bedingungen verwendet werden kann. Um zu beurteilen, ob der Einfluss einer Mutation (oder eines Gen-Knock-downs) oder einer pharmakologischen Behandlung auf das Verhalten einer Fliege auf einen ASD-ähnlichen Phänotyp hinausläuft, kann man eine Kombination dieser 5 hier beschriebenen Assays verwenden.

Protocol

In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden. 1. Aggressions-Assay Vorbereitung der Aggressions-Assay-ArenaNehmen Sie eine Standard-24-Well-Platte (Abbildung 1A) und verwenden Sie jede Vertiefung der Platte als eine einzelne “Arena” (Abbildung 1B) für die Aggression der Fliegen. Füllen Sie die Hälfte jeder Mulde mit normalem Fliegenfutter und lassen Sie es über Nacht trocknen.HINWEIS: Optional kann ein Brennpunkt für Aggression in die Arena eingebaut werden, z. B. ein Punkt Hefepaste oder ein enthauptetes Weibchen, um die männliche Aggression zu gewährleisten. Nehmen Sie eine durchsichtige Kunststoff-/Acrylplatte, die ausreicht, um die Oberfläche von etwa drei bis vier Vertiefungen zu bedecken. Perforieren Sie das Blech, um eine kleine Öffnung von ~2,5 mm Durchmesser zu erhalten, durch die Sie einzelne Fliegen in die Vertiefungen einführen können. Vorbereitung des FliegensaugersNehmen Sie einen 30-50 cm langen Gummi-/Silikonschlauch (Abbildung 1C1). Nehmen Sie eine 200 μl (oder 1.000 μl) Pipettenspitze und schneiden Sie ~1 cm von der schmalen Spitze ab. Führen Sie das abgeschnittene Ende an einem Ende des Gummischlauchs ein; Diese Spitze ist das “Mundende”, das für die Aspiration im Mund verwendet wird. Nimm eine weitere Pipettenspitze und schneide das schmale Ende dieser Spitze ab, um eine Öffnung zu schaffen, durch die eine Fliege eindringen kann. Führen Sie den Boden dieser Pipettenspitze in das hintere Ende des Röhrchens ein; Dies ist das “Fliegende” des Aspirators, von wo aus die Fliege angesaugt wird (Abbildung 1C2). Legen Sie ein Stück Netztuch oder eine dünne Schicht Baumwolle auf das “fliegende Ende” des Schlauchs – an der Verbindungsstelle zwischen dem Schlauch und der Spitze. Stellen Sie sicher, dass eine in die Pipettenspitze aspirierte Fliege in der Spitze vor dem Netz gefangen bleibt. Versiegeln Sie die Verbindungsstellen zwischen dem Rohr und den Pipettenspitzen mit Parafilm. Vorbereitung von Eingehäuseröhrchen und Fläschchen mit GruppengehäuseVorbereitung von einhausigen RohrenGeben Sie fast 500 μl frisch zubereitetes Fliegenfutter in ein 2-ml-Mikrofugenröhrchen (Abbildung 1D). Ziehe die Lebensmittel mit einer Mini-Zentrifuge in den unteren Teil des Röhrchens. Stellen Sie die Lebensmittel so ein, dass sie bei Raumtemperatur fest werden, indem Sie den Deckel über Nacht offen lassen. Decken Sie die Röhren mit einem feinen Stück Stoff ab, um zu verhindern, dass streunende Fliegen in die Röhren eindringen. Perforieren Sie die Deckel der Mikrofuge-Röhrchen mit Nadeln für die Luftzirkulation und schließen Sie die Deckel, nachdem die Lebensmittel fest geworden sind. Vorbereitung von Fläschchen für die GruppenhaltungNehmen Sie normale Fliegenfläschchen und füllen Sie ein Minimum der Fläschchen mit frisch zubereiteten Lebensmitteln (Abbildung 1D). Vorbereitung der Fliegen vor dem ExperimentBewahren Sie Fliegenlinien der gewünschten Genotypen in normalen Glas-/Plastikflaschen mit Standard-Fliegenfutter in einem Inkubator bei 25 °C in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus auf. Sammeln Sie neu eingeschlossene (0 bis 24 h) Fliegen des gewünschten Genotyps und trennen Sie sie unter Kohlendioxid-Narkose mit einem Stereomikroskop. Die Hälfte der männlichen Fliegen wird einzeln in “Ein-Gehäuse-Röhrchen” eingesetzt. Halten Sie die andere Hälfte der männlichen Fliegen in einer Gruppe von 10 Fliegen, während die weiblichen Fliegen in normalen “Gruppenhaltungsfläschchen” gehalten werden, um einen sozialen Zustand zu schaffen. Lagern Sie alle Röhrchen und Durchstechflaschen 5 Tage lang bei 25 °C.HINWEIS: Halten Sie eine Temperatur von 24-25 °C und ~50% Luftfeuchtigkeit im Verhaltensraum aufrecht. Die verwendeten Fliegenstämme waren: w1118 und FMR trans-heterozygote mutierte Fliegen (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Fmr1-Fliegen , die 5 Tage lang isoliert gehalten wurden, zeigen signifikant verminderte Aggressionsschübe gegenüber einem anderen Männchen (Abbildung 1E). Durchführung des AggressionsverhaltensexperimentsFühren Sie das Aggressionsexperiment während des Zeitfensters ZT0-ZT3 durch, da die Fliegen zu dieser Tageszeit die maximale Aktivität zeigen.HINWEIS: ZT=Zeitgeberzeit in einem Standard-Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden; ZT0= leuchtet an, d.h. der Beginn der Lichtphase, ZT3= 3 h nach Beginn der Lichtphase usw. ZT12= leuchtet aus. Übertragen Sie zwei männliche Fliegen entweder aus den Einzel- oder Gruppenhaltungskammern durch die Mundaspirationsmethode in die Aggressionsarena durch das Loch im Deckel; Schieben Sie das Loch sofort weg, um sicherzustellen, dass die Fliegen nicht entkommen können. Lassen Sie die Fliegen 1-2 Minuten in der Arena akklimatisieren. Starten Sie einen Timer für 20 Minuten. Nehmen Sie die Fliegen während der gesamten 20 Minuten auf Video auf, indem Sie eine Kamera oder ein Mobiltelefon mit einem Ständer genau senkrecht über der Arena platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Arten von aggressiven Kämpfen im Video sichtbar sind.HINWEIS: Sorgen Sie für eine klare Ausleuchtung der Arena und vermeiden Sie, dass Blendung/Reflexion vom Deckel direkt auf das Objektiv der Kamera fällt. Wiederholen Sie das Experiment mit 15-20 Fliegenpaaren für jeden Genotyp und jede Art von Haltungszustand.HINWEIS: Unbewusste Verzerrungen können durch Doppelverblindung der Kontroll- und Testfliegen sowie von Videodateien, die zu mehreren Genotypen gehören, negiert werden. Analyse der Aggressions-Assay-DatenÜbertragen Sie die Videodateien auf einen Computer mit ausreichend großem Bildschirm, damit die aggressiven Kämpfe sichtbar sind. Spielt das Video ab und zählt die Gesamtzahl der aggressiven Kämpfe in einer Zeitspanne von 20 min58,59. Stellen Sie die Daten jedes Genotyps und jedes Haltungsmusters in einer Tabelle zusammen und organisieren Sie sie in einer Tabelle und führen Sie Datenanalysen mit einer beliebigen Statistiksoftware durch. Führen Sie einen zweiseitigen t-Test durch, und stellen Sie die Daten als Quader und Whisker dar. 2. Assay für den sozialen Raum HINWEIS: Das hier beschriebene Analyseprotokoll, die Arena und die Analyse wurden bereits beschrieben60,61. Vorbereitung des Social Space Assay (SSA) ArenaPlatzieren Sie die beiden dreieckigen Acryl-Abstandhalter (Höhe = 8,9 cm, Basis = 6,7 cm und Dicke = 0,3 cm) flach auf einer rechteckigen Glasscheibe (13,5 cm x 10,4 cm, Dicke 0,3 cm), so dass die rechten Winkel der Acryl-Abstandhalter mit den Ecken der Glasscheibe ausgerichtet sind (Abbildung 2A). Legen Sie zwei rechteckige Acryl-Abstandhalter (6,7 cm x 1,5 cm, Dicke = 0,3 cm) flach auf die Glasscheibe, ausgerichtet auf die Füße der beiden dreieckigen Abstandhalter. Nach dieser Anordnung ist zu bestätigen, dass die vier Acryl-Abstandhalter auf der rechteckigen Glasscheibe eine dreieckige Arena (~2,16 cm²61) umgeben, die nicht von Abstandhaltern verdeckt ist (Abbildung 2A,B). Kleben Sie einen Aufkleber eines Lineals (Abbildung 2C) auf einen der dreieckigen Abstandshalter und achten Sie darauf, dass er von oben sichtbar ist. Platzieren Sie nun eine zweite rechteckige Glasscheibe (13,5 cm x 10,4 cm, Dicke 0,3 cm) so auf die Acryl-Abstandhalter, dass sie mit der Glasscheibe unten ausgerichtet ist; Acryl-Abstandhalter würden zwischen dem Glasraum eingeklemmt werden, so dass in der Mitte zwischen zwei Glasscheiben ein dreieckiger Raum entsteht. Verwenden Sie vier kleine Heftklammern, um die Scheiben und Abstandshalter zu halten. Vorbereitung der Fliegen für SSASammeln Sie neu eingeschlossene (0 bis 24 h) Fliegen des gewünschten Genotyps und trennen Sie sie unter kalter Narkose mit einem Stereomikroskop vom Geschlecht.HINWEIS: Kühlen Sie das Kälteanästhesiegerät (es kann eine Petrischale verwendet werden) in einem -20 °C Inkubator. Legen Sie die Fliegen in leere Fläschchen, tauchen Sie diese Fläschchen in Eis (in einen Eiskübel), bis die Fliegen unbeweglich werden, legen Sie sie auf die kalte Petrischale und beginnen Sie mit dem Sortieren. Lagern Sie die männlichen und weiblichen Fliegen getrennt für 24 h in Futterfläschchen in einem 25 °C Inkubator mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.HINWEIS: Für die hier gezeigten Experimente wurden Fliegenstämme w1118 und FMR-transheterozygote mutierte Fliegen (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M) verwendet. Durchführen des SSA-ExperimentsBehalten Sie die gleichen experimentellen Bedingungen wie beim Aggressionsassay bei (Temperatur: 24-25°C, Luftfeuchtigkeit ~ 50%) und führen Sie das Experiment während des Zeitfensters ZT0-ZT3 durch. Entfernen Sie die untere rechte Binderklammer und verschieben Sie den rechteckigen Abstandshalter leicht nach außen, so dass zwischen den beiden rechteckigen Abstandshaltern ein Spalt (~0,5 cm) entsteht. Fliegen (am Vortag gesammelt) aus dem Futterfläschchen in ein leeres Fläschchen umfüllen. Übertragen Sie sie in die soziale Raumarena (den dreieckigen Bereich) durch sanftes Aspirieren durch den zwischen den rechteckigen Abstandshaltern geschaffenen Raum. Schließen Sie den Raum sofort, indem Sie den rechteckigen Abstandshalter und den Bindeclip wieder in ihre Position schieben und sicherstellen, dass kein Platz mehr bleibt, aus dem die Fliegen entweichen können. Indem Sie die Kammer in der aufrechten Position halten, klopfen Sie die Kammer vorsichtig 3x auf ein weiches Pad, um sicherzustellen, dass sich zu Beginn des Experiments alle Fliegen am Boden der Kammer befinden. Klemmen Sie die SSA-Kammer in die aufrechte Position und starten Sie den Timer. Machen Sie nach 20 Minuten ein klares Foto von der Arena, wenn sich die Fliegen an ihren Positionen in der Arena niederlassen und minimale Bewegungen zeigen. Vermeiden Sie Blendung und unregelmäßige Beleuchtung. Wiederholen Sie das Experiment 3x für dieselbe Fliegenpopulation, indem Sie die Fliegen hämmern und die Schritte aus den Schritten 2.3.5 bis 2.3.7 (interne Replikate) wiederholen. Wiederholen Sie 3x mit einer anderen Population von Fliegen desselben Genotyps/Zustands (unabhängige Wiederholungen).HINWEIS: Frieren Sie die Assay-Kammer ein, um die Fliegen aus der Kammer zu entfernen. Wischen Sie die Glas- und Kunststoffoberflächen mit Ethanol ab, um alle Gerüche zu entfernen, nachdem eine Versuchsrunde mit einer Gruppe von Fliegen durchgeführt wurde. Analyse der Assay-Daten aus dem SozialraumAnalysieren Sie die Bilder in der ImageJ62-Software , und listen Sie die Entfernungen zwischen den Flügen zum nächsten Nachbarn auf, wie zuvor beschrieben61. Führen Sie statistische Analysen durch und zeichnen Sie Diagramme mit Statistiksoftware.HINWEIS: Bei den für den hier beschriebenen SSA-Assay verwendeten Fliegenstämme handelte es sich um w1118 und Fmr1 trans-heterozygote mutierte Fliegen (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Fmr1-Fliegen zeigen einen signifikant vergrößerten Abstand zu den nächsten Nachbarn (Abbildung 2D). 3. Balz-Assay Die BalzkammerSetze alle vier Teile der Balzkammer (Abbildung 3A) in der in Abbildung 3B gezeigten Reihenfolge zusammen. Jede Perforation der zentralen Scheibe, die zwischen dem Deckel und den Basisstücken eingeklemmt ist, fungiert als “Balzkammer” (Abbildung 3C). Gewinnung von vorverpaarten WeibchenStarten und pflegen Sie mehrere Kulturflaschen mit CS-Fliegen (Canton S, Wildtyp) mit ~60-100 männlichen und weiblichen Fliegen in jeder Futterflasche. Wenn erwachsene Fliegen schlüpfen, entsorgen Sie alle erwachsenen Fliegen und übertragen Sie die aus diesen Flaschen schlüpfenden Fliegen alle 2-3 Stunden in neue Futterfläschchen, die mit einer winzigen Menge Hefepaste ergänzt werden.HINWEIS: Vermeiden Sie eine Überfüllung der Durchstechflaschen. Achten Sie darauf, keine alten Fliegen, Larven oder Puppen in das Paarungsfläschchen zu übertragen. Inkubieren Sie diese “Paarungsfläschchen” 4 Tage lang, um sicherzustellen, dass sich alle Weibchen gepaart haben. Vorbereitung von Einhausungsröhrchen für männlicheGeben Sie fast 500 μl Fliegenfutter in jedes 2-ml-Mikrofuge-Röhrchen. Ziehe die Lebensmittel mit einer Minizentrifuge in den unteren Teil des Röhrchens. Lassen Sie die Lebensmittel über Nacht erstarren, schneiden Sie den Deckel des Mikrofugenröhrchens ab, decken Sie es mit Parafilm ab und perforieren Sie den Parafilm mit einer Nadel für die Luftzirkulation. Entnahme und Isolierung von jungfräulichen MännchenKreuzungen mit 10-15 Männchen und 20-30 jungfräulichen Weibchen der gewünschten Genotypen in separaten Futterfläschchen einrichten. Sammeln Sie jungfräuliche Männchen der gewünschten Genotypen aus den Nachkommen und halten Sie sie einzeln in “Ein-Haltungs-Röhren” mit dem Aspirator. Sammeln Sie alle 5-6 Stunden neu geschlossene Männchen (bis zu 40-50 Männchen für jeden Genotyp) und isolieren Sie sie in einzelnen Röhrchen mit nur einer Haltung. Verschließen Sie den Deckel der Tube wieder mit dem Parafilm. Durchführung des Balz-Assay-ExperimentsNach 5 Tagen Isolation der Testmännchen ist der Balztest während des Zeitfensters ZT0-ZT3 durchzuführen. Richten Sie die Videoaufzeichnungsgeräte frühzeitig ein und konzentrieren Sie sich dabei auf den Assay-Arbeitsbereich. Entnehmen Sie mit Hilfe eines Aspirators ein vorverpaartes Weibchen (6-10 Tage alt) aus den Paarungsfläschchen und legen Sie es in eine Balzkammer. Mit dem Aspirator wird ein Männchen (Kontroll-/Testfliege) vorsichtig aus dem Einzelgehäuseschlauch durch das Übertragungsloch in die Balzkammer mit dem einzigen vorverpaarten Weibchen übertragen. Drehen Sie den Deckel schnell, um die Kammer zu schließen. Video zeichnet das Verhalten der Fliegen 15 Minuten lang auf. Videodatenanalyse und StatistikÜbertragen Sie die Videodateien auf einen Computer; Notieren Sie sich die Zeit, die das Männchen während 15 Minuten bei der Balz verbringt, indem Sie das Video manuell durchgehen. Berechnen Sie den Balzindex (CI) für jede männliche Fliege, der den Bruchteil (oder Prozentsatz) der Zeit angibt, die das Männchen 15 Minuten lang damit verbracht hat, das Weibchen zu umwerben. Zählen Sie die Gesamtzahl der Kopulationsversuche in 15 Minuten. Beachten Sie die Dauer der Zeitverzögerung, die das Männchen vor seinem ersten Versuch zu werben als Balzlatenz (CL) anzeigt.HINWEIS: Es wird empfohlen, 40-60 Männer pro Zustand/Genotyp zu analysieren, um eine statistische Aussagekraft zu erreichen und die Konsistenz der CI-Ergebnisse zu bestimmen. 4. Assay des Fellpflegeverhaltens Arena für Assays für das PflegeverhaltenVerwenden Sie eine kleine kreisförmige Kammer mit einem Volumen von ~0,4 cm3 als Arena für die Aufzeichnung des Pflegeverhaltens.HINWEIS: Dieselbe Balzarena, die in Abschnitt 3 beschrieben ist, kann für die Untersuchung des Pflegeverhaltens verwendet werden. Da das Pflegeverhalten die Aufzeichnung der Bewegung feinerer Organe wie Beine beinhaltet, verwenden Sie hochauflösende oder kontrastreiche Videoaufnahmen. Um dieses Protokoll zu befolgen, verwenden Sie ein diffuses, glasbedecktes LED-Panel als gleichmäßig beleuchtete Fläche mit den Maßen 20 cm x 20 cm. Platzieren Sie die Balzkammer auf der Platte, um sicherzustellen, dass das Licht von unten durch die Kammer fällt. Vorbereitung der Fliegen vor dem ExperimentHalten Sie experimentelle Genotyp-Fliegen in Lebensmittelflaschen bei 25 °C mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus. Sammeln Sie neu eingeschlossene (0 bis 24 h) Fliegen des gewünschten Genotyps und trennen Sie sie unter kalter Narkose mit einem Stereomikroskop, wie im Sozialraum-Assay beschrieben. Die männlichen Fliegen werden 24 Stunden lang in Röhrchen mit nur einem Gehäuse (wie im Aggressionstest verwendet) isoliert.HINWEIS: Für das hier gezeigte Experiment wurden folgende Fliegenstämme verwendet: W1118 und FMR trans-heterozygote mutierte Fliegen (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M). Durchführung des Grooming-Verhaltens-AssaysHalten Sie eine Temperatur von 24-25 °C und eine Luftfeuchtigkeit von ~ 50% aufrecht; Führen Sie das Experiment während des Zeitfensters ZT0-ZT316 durch. Bringen Sie ein Männchen mit einem Gehäuse aus einem Einhauseschlauch in die Fellpflegearena, indem Sie einen Aspirator verwenden. Schieben Sie das Loch im Deckel sofort weg, um sicherzustellen, dass die Fliegen nicht entweichen können. Platzieren Sie die Putzarena auf einer diffusen LED-Platte und lassen Sie die Fliege 1 Minute lang in der Arena akklimatisieren. Nehmen Sie die Fliege 10 Minuten lang auf Video auf, indem Sie die Kamera genau senkrecht über der Arena auf einem Ständer platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Arten von Pflegekämpfen im Video sichtbar und quantifizierbar sind.HINWEIS: Das Fellpflegeverhalten umfasst das Reiben von Kopf, Augen, Antennen, Rüssel, Thorax, Bauch, Genitalien und Flügeln mit Beinen (erstes Paar: T1, zweites Paar: T2 oder drittes Beinpaar: T3). Die in dieser Studie berücksichtigten Parameter des Grooming-Verhaltens sind wie in Andrew et al. 41 beschrieben und in Abbildung 4 dargestellt. Wiederholen Sie den Versuch für jeden Genotyp. Analyse der Grooming-VerhaltensdatenAnalysieren Sie die Videos und berechnen Sie die folgenden vier Parameter: Grooming-Index (Prozentsatz der Zeit, die für die Pflege aufgewendet wird); Grooming-Latenz (Zeit bis zum ersten Grooming-Kampf); Anzahl der Pflegekämpfe; und die durchschnittliche Dauer des Pflegekampfes (Gesamtdauer des Kampfes/Kampfanzahl). Markieren Sie einen einzelnen Putzkampf als beendet, wenn eine Fliege entweder keinen der Parameter mehr anzeigt und 2 s lang bewegungslos verharrt oder den Kampf stoppt und mindestens 4 Schritte geht. 5. Assay zur Geruchsgewöhnung HINWEIS: Wie in Abbildung 5 gezeigt, muss die Endmontage am Tag des Y-Labyrinth-Assays54,56 erfolgen. Fliegen auf die Gewöhnung vorbereitenAufziehen Sie Fliegen der gewünschten Genotypen für alle Experimente in einem Inkubator mit einer Umgebungstemperatur von 25 °C und 70% Luftfeuchtigkeit unter dem Standard 12 h Licht: 12h h Dunkelzyklus (LD). Sammeln Sie 0-12 h alte, neu geschlossene Fliegen und übertragen Sie ~30-40 Fliegen in eine frische mittelgroße Flasche mit einem festgezogenen Baumwollstopfen. Weisen Sie jeder Flasche Codes zu, um den Experimentator über die zu experimentierenden Genotypen blind zu halten. Induktion der olfaktorischen GewöhnungGeben Sie 1 ml des bevorzugten Odoriermittels, verdünnt mit Paraffinflüssigkeit (leicht), in ein 1,5 mL Mikrofugenröhrchen. Für die Kontrolle verwenden Sie einfach 1 mL Paraffin-Flüssiglicht in einem 1,5 mL Mikrofugenröhrchen. Den Inhalt 10 Minuten lang in der Tube vortexen, um eine gleichmäßige Durchmischung zu gewährleisten, und dann mit gleichmäßig perforierter Plastikfolie abdecken.HINWEIS: Im Video wird 20% Ethylbutyrat verwendet. Verwenden Sie Draht, um die Röhrchen mit dem verdünnten Odoriermittel oder nur die Verdünnungsflüssigkeit in separate Medienflaschen mit Fliegen aufzuhängen. Decken Sie die Flaschen gut mit Watte ab und wickeln Sie sie dann mit Kraftpapier ein, um eine Diffusion des Geruchsdampfes zu verhindern. Kennzeichnen Sie die Kontroll- und geruchshaltigen Flaschen als naiv bzw. geruchsexponiert (habituiert). Bewahren Sie diese Induktionsflaschen 3 Tage lang in einem Inkubator unter den oben genannten Bedingungen auf. Vorbereitung der Fliegen und des Y-Labyrinth-ApparatsFüllen Sie die Fliegen aus den Induktionsflaschen in Fläschchen um, die nur wassergetränktes Filterpapier enthalten. Lassen Sie sie vor dem Experiment ca. 16-18 Stunden bei Raumtemperatur hungern, um die Motivation zu steigern. Stellen Sie sicher, dass die Komponenten des Y-Labyrinth-Geräts sauber und geruchsfrei sind. Bauen Sie die vier Teile vertikal zusammen. Befestigen Sie die Kletterkammern am Y-Labyrinth, das dann mit der Oberseite des Adapters verbunden wird. Befestigen Sie den Boden des Y-Labyrinths fest mit dem Einführungsfläschchen, das als zentraler Stiel an der Unterseite dient, wie in Abbildung 5 gezeigt. Verbinden Sie das sich verjüngende Ende jeder Kletterkammer mit den Reagenzflaschen, die das Odormittel enthalten (10-3 Verdünnung mit destilliertem Wasser), mit geruchsfreien Silikonschläuchen. Pumpen Sie das Odormittel mit Hilfe einer Vakuumpumpe mit gleicher Durchflussrate (~120 mL/min) aus den Gasflaschen zu den beiden Armen des Y und lassen Sie es 15 Minuten lang sättigen, um die Konsistenz zu gewährleisten. Durchführung des klassischen Y-Labyrinth-AssaysFühren Sie die ausgehungerten Fliegen jedes Fläschchens vorsichtig in das Eingangsfläschchen des Y-Labyrinth-Setups ein. Lassen Sie sie sich für eine kurze Zeit akklimatisieren; Verbinden Sie das Einführfläschchen mit dem Y-Maze-Adapter, um den Test zu starten. und lass die Fliegen die Y-Labyrinth-Arme erklimmen und in den beiden Sammelkammern gefangen werden. Legen Sie die Zeitdauer jedes Tests auf 1 Minute fest. Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, klopfen Sie die Fliegen zurück an den Boden des Einführfläschchens und ändern Sie die Position der Arme des Y-Labyrinths, um eine seitliche Verzerrung zu vermeiden. Nehmen Sie vier Messungen für denselben Satz Fliegen vor. Notiere die Anzahl der Fliegen, die jeden der beiden Arme des Y-Labyrinths innerhalb der Zeitdauer erklimmen. Wiederholen Sie den Assay für mindestens 8 Chargen, um einen repräsentativen Datensatz zu erhalten. Analyse und Interpretation der gesammelten DatenQuantifizieren Sie die Ergebnisse, indem Sie den Performance Index (PI) berechnen, der als Differenz zwischen der Anzahl der Fliegen, die den Luftarm (A) wählen, und der Anzahl der Fliegen, die den Geruchsarm (O) wählen, als Bruchteil der Gesamtzahl der teilnehmenden Fliegen dargestellt werden kann. Verwenden Sie statistische Tests (ungepaarter Student’s t-Test), um zu überprüfen, ob die PI von naiven und geruchsexponierten Fliegen signifikant ist.

Representative Results

Aggressions-AssayAls Fliegen-ASD-Modell wurden Fmr1-mutierte Fliegen verwendet63,64. w1118 Männchen wurden als Kontrolle und Fmr1 trans-heterozygote Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 männliche Fliegen als Versuchsfliegen verwendet; Erwachsene Männchen wurden 5 Tage lang in Isolationsröhren untergebracht. Homotypische Männchen (gleicher Genotyp, gleiche Haltungsbedingungen) wurde…

Discussion

Drosophila wird aufgrund eines hohen Grades an Konservierung von Gensequenzen zwischen Fliegen- und menschlichen Krankheitsgenen als guter Modellorganismus für die Erforschung humaner neurologischer Erkrankungen verwendet9. Zahlreiche robuste Verhaltensparadigmen machen es zu einem attraktiven Modell für die Untersuchung von Phänotypen, die sich in Mutanten manifestieren, die menschliche Krankheiten rekapitulieren. Da Hunderte von Genen an der Autismus-Spektrum-Störung (ASS) beteiligt…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Mani Ramaswami (NCBS, Bangalore) und Baskar Bakthavachalu (IIT Mandi) für das Setup des Gewöhnungs- und Geruchsauswahl-Assays, Pavan Agrawal (MAHE) für seine wertvollen Vorschläge zum Aggressions-Assay, Amitava Majumdar (NCCS, Pune) für das Teilen seines Prototyps der Balz-Assay-Kammer und der Fmr1-Mutantenfliegenschnüre und Gaurav Das (NCCS, Pune) für die Bereitstellung der MB247-GAL4-Linie. Wir danken dem Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana, USA), dem National Institute of Genetics (NIG, Kyoto, Japan), der Banaras Hindu University (BHU, Varanasi, Indien) und dem National Center for Biological Science (NCBS, Bangalore, Indien) für die Drosophila-Linien . Die Arbeit im Labor wurde durch Zuschüsse von SERB-DST (ECR/2017/002963) an AD, ein DBT Ramalingaswami-Stipendium für AD (BT/RLF/Re-entry/11/2016) und institutionelle Unterstützung vom IIT Kharagpur, Indien, unterstützt. SD und SM erhalten Ph.D.-Stipendien vom CSIR-Senior Research Fellowship; PM erhält ein Ph.D.-Stipendium von MHRD, Indien.

Materials

Aggression arena:
Standard 24-well plate made of transparent polystyrene 12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm
Transparent plastic/acrylic sheet Alternative: a perforated lid of a cell culture plate
Social Space Assay:
Binder clips 19 mm
Glass sheets and acrylic sheets of customized sizes Thickness = 5 mm
Courtship assay:
Nut and bolt with threading
Perspex sheets of customized shapes i) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole
Grooming assay:
Diffused glass-covered LED panel 10–15-Watt ceiling mountable LED panel
Habituation and Y-maze assay
Climbing chambers x2, Borosilicate glass
Adapter for connecting Y-maze with entry vial Perspex, custom made, measurements in Figure 5A
Clear reagent bottles Borosil #1500017
Gas washing stopper Borosil #1761021
Glass vial OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Odorant (Ethyl Butyrate) Merck #E15701
Paraffin wax (liquid) light SRL #18211
Roller clamps Polymed #14098
Silicone tubes OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control
Vacuum pump Hana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)
Y-maze Borosilicate glass
Y-shaped glass tube (borosilicate glass) Custom made, measurements in Figure 5A
Common items:
Any software for video playback (eg.- VLC media player) https://www.videolan.org/vlc/
Computer for video data analysis
Fly bottles OD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene
Fly vials OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass
Graph-pad Prism software https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ software https://imagej.net/downloads
Timer
Video camera with video recording set up Camcorder or a mobile phone camera will work
For Fly Aspirator:
Cotton Absorbent, autoclaved
Parafilm Sigma-aldrich #P7793
Pipette tips 200 µL or 1000 µL, choose depeding on outer diameter of the silicone tube
Silicone/rubber tube length= 30-50 cm. The tube should be odorless
Composition of Fly food:
Ingredients (amount for 1 L of food)
Agar (8 g) SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)
Cornflour (80 g) Organic, locally procured
D-Glucose (20 g) SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Propionic acid (4 g) SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sucrose (40 g) SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g) SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Yeast Powder (10 g) HIMEDIA # RM027
Fly lines used in the experiments in this study:
Wild type (Canton S or CS) BDSC # 64349
w1118 BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+] BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1] BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India) BDSC # 50742
LN1-GAL4 NP1227, NP consortium, Japan
row-shRNA BDSC # 25971

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Diesen Artikel zitieren
Dey, S., Mondal, P., Mandal, S., Sasmal, S., Chakraborty, N., Das, A. Paradigms for Behavioral Assessment in Drosophila Model of Autism Spectrum Disorder. J. Vis. Exp. (211), e66649, doi:10.3791/66649 (2024).

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