对小鼠高度重复的低水平爆炸暴露进行建模

所有程序均根据协议 #1588223 进行，该协议由退伍军人事务部普吉特海湾医疗保健系统机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南。 1. 动物护理 注意：LLB 的动物模型仅受其可用性和减震管容量的限制，以适应其大小。此处描述的休克管是专门为小鼠设计的。 根据实验需要，使用 3-4 个月大的雄性或雌性 C57BL/6J 小鼠或其他经批准的小鼠品系/品系。将小鼠维持在特定的无病原体设施中 12 小时的暗光循环中，可 随意 获取食物和水。小鼠通常被关在一个笼子里，有 4 或 5 只。将设施温度保持在 20-22 °C。 将装有 Mlast 和 Sam 老鼠的笼子带到附近的饲养区。带上单独的空笼子，以便将单只小鼠转移到鼓炎室或从喷砂室转移。 2. 减震管准备 （安全检查） 确认已完成特定系统的必要安全检查。确保气源（氦气）和主电源已关闭/断开。 根据需要准备膜，以进行特定数量的低强度喷射（图 1.1）。根据本协议中使用的特定减震管的要求切割膜尺寸：将一张塑料保鲜膜切成 5.5 英寸 x 5.5 英寸的正方形以密封线轴，使其加压。 将一张标准 8.5 英寸 x 11 英寸复印纸（75 克/米2 重量）切割成 5.5 英寸 x 11 英寸;将生成的纸张对折，形成一个 5.5 英寸 x 5.5 英寸的正方形。 获得一张 500 G 聚酯薄膜（125 μm 厚度）。注意：这些片材不会因标准低强度喷砂而破裂或明显变形，并且可以在一天的手术期间重复使用。 取一块正方形的保鲜膜和一块折叠的纸，将它们放在平坦的表面上（图 1.2）。将折叠好的纸放在保鲜膜的顶部，并尽可能将两者对齐（图 1.3）。为了加快重复的爆炸速度，现在就安排好所有的膜堆栈。 将聚酯薄膜卷成一根小管（大约与食指一样大;图 1.4,1.5）。将其完全插入机构中，然后松开以使其在将驱动器部分与线轴分开的橡胶密封件上展开。将线轴推向驱动器以将聚酯薄膜片固定到位;这将从减震管的驱动部分解封线轴。 将手指放在保鲜膜的上半部分下方，小心地将保鲜膜和纸张朝您的方向滚动，确保它们一起卷起而不会错位（图 1.6）。 将膜组插入线轴和减震管的驱动部分之间（图 1.7）。 让膜叠展开，使塑料密封件朝向线轴，而纸张朝向管的驱动部分（图 1.8）。注意：此方向将形成气密密封，以便系统可以加压。 关闭线轴组件（图 1.9、1.10）。根据需要，用手或液压拧紧螺栓，固定驾驶员滑阀芯减震管组件，以便系统可以加压。（安全检查;图 1.10）注意：对于液压系统，请确保达到瓶盖组件的目标压力，以防止失火，这可能需要更换膜并减慢 LLB 暴露过程。我们使用液压系统在 500 psi 的压力下关闭我们的组件。 3. 动物准备 打开麻醉室下方的循环水加热垫，温度设置为 37 °C（图 1.11）。在加热垫顶部放置一个吸水医用垫。 在拘留室中，从其家笼中取出一只鼠标，并将其放入空的转移笼中。将笼中老鼠带入喷砂室。 将氧气流速调至 1.0 L/min （lpm） 并打开真空扫气系统（图 1.12）。 将异氟醚调至 5%（以诱导快速失去知觉）并将流量引导至啮齿动物麻醉室（图 1.13）。 将鼠标放入腔室中以诱导麻醉（图 1.14）。 一旦小鼠完全麻醉并表现出稳定的呼吸 30 秒，伸手进入腔室并敲击鼠标，以便在研究的剩余时间内明确地长期识别小鼠。现在执行此步骤是必要的，以避免干扰爆炸后的恢复时间。然后，将无菌眼用润滑剂涂抹在双眼上，以防止角膜干燥。 从腔室中取出鼠标，将其鼻子放入鼻锥中（图 1.15）。将麻醉液（例如异氟醚）从诱导室切换到鼻锥。 使用小块实验室胶带轻轻地将小鼠的四肢束缚在轮床上（图 1.16）。 束缚鼠标后，将金属丝扭结带绕在每个肢体上并拧紧，将鼠标固定在手腕和脚踝的轮床上（图 1.17）。在胸部周围放一条较大的扭结带，系得非常松散，这样老鼠的呼吸就不会受到限制。这将作为辅助约束机制，以防任何肢体约束装置松动。 抬起鼠标的尾巴并将其放在左脚下方，以确保在将轮床插入减震管时它不会被夹住（图 1.18）。 4. 法学学士程序 打开激波管的动物暴露部分并调整鼠标的方向，使其面向迎面而来的冲击波（图 1.19）。 将轮床固定/悬挂在动物暴露部分（图 1.20）。 关紧动物暴露部分的门，确保麻醉液流管不被门夹住（图 1.21）。 将麻醉剂减少至 2.5-3% 异氟醚，在剩余的疗程中为 1 升/分钟。 根据需要为系统供电（图 1.22）。 找到并连接压缩氦气的供应管线（图 1.23、1.24）。 离开喷砂室，进入相邻房间的喷砂管控制台，并确保喷砂室内没有人员或动物。注意：机构或运营条件可能需要听力保护。此类情况可能包括控制台与减震管位于同一开放空间的减震管布置。 在控制台上，打开采集软件以记录爆炸事件（参见图 1.25 中的绿色框）。注意：对于这些程序，我们以 20 千克赫兹 （kHz） 的采样率收集传感器数据，然后使用 LabView 软件进行处理。我们建议以 ≥10 kHz 的频率采集传感器采样，以获得高质量的时间与压力曲线。 松开任何安全锁（例如，电源控制键，如图 1.26 中的绿色箭头所示）。 关闭两个排气口并被动地对阀芯加压（图 1.27）。请勿使用驾驶员侧。继续填充，直到膜在目标峰 psi 处自行破裂，该峰由使用的膜片数量决定。 记录动物位置的峰值压力、正相位持续时间和脉冲。（图 1.28）。关闭填充机制。 返回减震管，断开氦气进料管，并关闭爆炸控制电路的电源（图 1.29）。 要对同一只动物进行重复的 LLB 暴露，请打开线轴，取出线轴膜堆栈，然后滚动并插入另一个线轴膜堆栈（图 1.30、1.31、1.32）。展平膜堆栈并重新合上组件。注意：为了模拟经验定义的 SOF 训练期间低水平爆炸暴露的临床体验，我们每天将小鼠暴露于 5-6 个 LLB，将每日暴露限制在保守的 ~20 累积总 psi45。强调机制和剂量-反应关系的研究可以选择使用一致数量的 LLB 暴露，每次会话具有定义的超压参数。 在当前动物的最终 LLB 之后，将其从休克管中取出，保持麻醉开启（图 1.33）。 在动物处于麻醉状态时解开动物的绳子。将其从麻醉鼻锥中取出，将其仰卧在加热的水垫上（图 1.34）。 一旦动物被放在水垫上，启动一个计时器并记录鼠标自行翻转到其腹侧（即胃）的时间（图 1.35）。将此时间记录为扶正时间。鼠标恢复后，将其放回笼子并根据需要继续监控。 5. 多日程序 为了模拟 SOF 近距离战斗训练期间使用的违规指控的常规 LLB 暴露，每周 5 天（周一至周五）每天对小鼠进行重复暴露，总共 15 天，共 3 个标准工作周。 6. 改变 LLB 峰值压力 通过使用更坚固的膜材料或简单地堆叠额外的膜来提高峰值压力。例如，使用 Mylar Roll Clear 0.005 （500 G） 膜产生 ~20 psi 峰值压力（当用作驱动膜和阀芯膜时）或 Mylar Roll Clear 0.002 （200 G） 膜产生 ~10 psi 峰值压力。 调整 blast 的正相位持续时间和脉冲参数，以满足实验需求。要调整正相位持续时间和脉冲，请通过替换压缩气源47,49 或尽可能更改驱动器长度来凭经验确定目标条件。上述协议使用氦气产生类似于理想化的弗里德兰德曲线的尖锐峰值压力和波形。 7. 组织采集 注：组织采集实践可根据实验需要进行调整。 通过腹膜内注射 210 mg/kg 戊巴比妥麻醉小鼠。 将鼠标放入带有杆或预制网格的小鼠或鼠笼中;将笼式鼠标放入通风橱中。 一旦鼠标没有反应，将其仰卧在笼子顶部的杆上，并在其中一根杆周围闭上嘴巴，以帮助它在灌注期间保持原位。 抓住胃的皮肤，向上拉，用一把大剪刀在腹腔上剪一个洞，小心不要割伤任何器官。继续沿着肋骨底部向下切得更远，以便更自由地铰接胸腔。 使用止血钳，从侧面接近鼠标，直接抓住胸腔顶部的组织，将止血钳向后滚动，以保持胸腔底部的角度处于易于接近的位置。使用一把镊子或类似工具将止血钳固定到位。 使用一把小手术剪刀，小心地剪断隔膜，以便进入心脏。使用一对镊子轻轻地调整心脏的角度，使底部直接面向胸腔的开放底部。快速工作，使心脏在灌注期间仍会跳动。 如果采集血液，用一对镊子夹住心脏，并使用 3 mL 注射器小心地刺穿右心室，注射器尖端有 0.5 英寸 25 G 针头。从心室底部插入并纵向插入，注意不要刺穿心室的另一侧。轻轻拉动注射器，直到收集到 0.5-1.0 mL 血液或血流停止，然后取出注射器。 用一把手术剪刀在右心房切一个小切口，让血液和灌注液排出。用一对镊子夹住心脏，小心地将 25 G 蝶针从底部插入左心室。用固定夹或用手将蝶针固定到位。 灌注动物。将装有 50 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的注射器连接到蝶形针头上，并以大约 10 mL/min 的速率灌注。寻找肝脏漂白作为适当灌注的标志。注射器排空后，将其与蝶形针头断开。 为了制备用于显微镜的组织，用含有 50 mL 10% 中性缓冲福尔马林 （NBF） 或 4% 甲醛溶液的注射器替换空的 PBS 注射器。重复上述步骤以灌注福尔马林。注意：应观察灌注小鼠在灌注过程中抽搐;这应该会导致手术完成后全身僵硬或僵硬。 从心脏中取出蝶针，从笼杆中取出鼠标以进行组织收集。 根据需要对靶器官进行切除和细分;收集新鲜、未固定的材料时，请小心在冰上执行程序。 快速冷冻在液氮中收集的任何未固定组织，并将其储存在 -80 °C 下，直至用于检测蛋白质或 RNA 靶标的方案。 对于固定组织，取出到装有福尔马林的标记 50 mL 锥形管中（每个器官 1 管）。