¹³Мечение_{C6-глюкозы}, ассоциированное с LC-MS: идентификация первичных органов растений в синтезе вторичных метаболитов

Пути биосинтеза вторичных метаболитов в растениях сложны и разнообразны, в них задействованы высокоспецифичные и^{разнообразные органы} накопления. В настоящее время специфические места синтеза и органы, ответственные за вторичные метаболиты во многих лекарственных растениях, четко не определены. Эта неопределенность представляет собой серьезное препятствие для стратегического продвижения и внедрения методов выращивания, разработанных для оптимизации как урожайности, так и качества лекарственных материалов.

Молекулярная биология, биохимия и методы мечения изотопов широко используются для раскрытия путей синтеза и сайтов вторичных метаболитов в лекарственных растениях 2,3,4,5, и каждая из этих методологий демонстрирует уникальные сильные стороны и ограничения, такие как различия в эффективности и точности. Подходы молекулярной биологии, например, обеспечивают высокую точность в определении сайтов в биосинтетических путях, но требуют значительного времени. Их полезность еще больше ограничена для видов, у которых отсутствуют общедоступные геномные последовательности, что делает эти методы менее жизнеспособными для^{таких случаев.} В противоположность этому, методы мечения изотопов, использующие изотопные соотношения, такие как ³C/¹²C, ²H/¹H и ¹⁸O/¹⁶O, обеспечивают быстрые и доступные средства для исследования механизмов синтеза, транспортировки и хранения вторичных метаболитов ^7,8. Они могут выявить пространственное распределение органических соединений и стабильных изотопов в листьях, тем самым позволяя реконструировать условия окружающей среды, с которыми сталкиваются листья на протяжении всего их^{жизненного цикла.} Кроме того, применение внешних изотопных меток, таких как ¹³C_6-Glucose ¹⁰ и ¹³C 6-Phenylalanine¹¹, позволяет генерировать меченные углеродом вторичные метаболиты, улучшая наше понимание их производства и функции.

Традиционные методы мечения изотопов углерода сталкиваются с трудностями в определении конкретных органов, ответственных за синтез вторичных метаболитов, из-за высокой видоспецифичной природы их биосинтетических путей и механизмов транспортировки. Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ-МС) приобрела известность в качестве ключевого аналитического инструмента в этой области, предлагая надежный метод отслеживания экзогенных изотопов в химическом синтезе лекарств и исследования in vivo таких процессов, как абсорбция, распределение, метаболизм и экскреция^. Превосходная чувствительность, прямолинейность и надежность ЖХ-МС делают его идеальным выбором для мониторинга производства вторичных метаболитов на предприятиях¹³. В последнее время LC-MS становится все более предпочтительным для его применения в методах мечения внешними изотопами, что позволяет оценить эффективность мечения для различных образцов. Данная методология дает критическое представление о первичных органах, участвующих в синтезе вторичных метаболитов лекарственных растений, служа неоценимым дополнением к биологическим методам идентификации органов синтеза этих соединений^14,15. Следовательно, такой подход не только облегчает сравнение эффективности мечения среди различных образцов, но и проливает свет на ключевые органы, участвующие в образовании вторичных метаболитов растений, тем самым улучшая наше понимание их биосинтеза.

Мы представили новый метод, который сочетает мечение изотопов углерода с обнаружением LC-MS для идентификации первичных органов, ответственных за синтез вторичных метаболитов в лекарственных растениях. Парижский сапонин (ПС) обладает различными фармакологическими свойствами, такими как противоопухолевое, иммуномодулирующее и противовоспалительное¹⁶, а ППИ пользуется все большим спросом¹⁷. Таким образом, мы использовали проростки PPY в качестве объектов исследования и расшифровали, что листья являются основным органом для синтеза парижского сапонина VII (PS VII) (рис. 1B) с помощью мечения ¹³C_6-Glucose, связанного с методом LC-MS. Наш подход включал в себя четыре различных метода лечения, включающих подачу ¹³_{С-6-глюкозы} в листья, корневище и стеблево-сосудистые пучки, а также контроль без кормления. Выбор ¹³_{С-6-глюкозы} является стратегическим, так как она быстро метаболизируется в ацетилкоэнзим А посредством дыхания, что в свою очередь способствует синтезу ФС. Используя естественное содержание ¹³C, мы использовали систему газовой хроматографии и масс-спектрометра стабильных изотопных отношений (GC-IRMS) для оценки соотношений ¹³C/¹²C в различных органах растений и для анализа изотопных ионных пиковых отношений в молекулах PS VII и парижских сапонинов II (PS II) (рис. 1B). Наша методология, в которой используются ¹³меченых С предшественников вторичных метаболитов растений и передовые методы масс-спектрометрии, предлагает более простую и точную альтернативу традиционным методам мечения изотопами углерода. Этот новый подход не только углубляет наше понимание органов, участвующих в синтезе вторичных метаболитов в лекарственных растениях, но и закладывает прочную основу для будущих исследований биосинтетических путей этих соединений.