13명LC-MS와 관련된 C6-포도당 라벨링: 2차 대사산물 합성에서 식물 일차 장기 식별
Summary
액체 크로마토그래피 고분해능 질량 분석법과 결합된 13C 6-Glucose 라벨링의 개발된 방법은 다재다능하며 약용 식물에서 2차 대사 산물의 합성에 관여하는 1차 장기 및 경로에 대한 향후 연구와 이러한 2차 대사 산물의 포괄적인 활용을 위한 토대를 마련합니다.
Abstract
이 논문은 2차 대사산물 합성에 관여하는 1차 장기를 인증하기 위한 새롭고 효율적인 방법을 제시합니다. Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.)에서 가장 중요한 2 차 대사 산물로 손. -Mzt. (PPY), 파리 사포닌 (PS)은 다양한 약리 활성을 가지고 있으며 PPY에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 이 연구는 파리 사포닌 VII(PS VII) 합성에 관여하는 주요 장기를 정확하게 인증하기 위해 잎, 뿌리줄기 및 줄기-혈관-번들 13C6-포도당 공급 및 비공급 4가지 처리를 확립했습니다. 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)을 결합하여 서로 다른 처리에서 잎, 뿌리줄기, 줄기 및 뿌리의 13C/12C비율을 빠르고 정확하게 계산하고 (M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M− 및 (M+4) −/M−의 4가지 유형의 PS 동위원소 이온 피크(M−) 비율을 찾았습니다. 그 결과, 줄기-혈관-다발 및 뿌리줄기 섭식 처리의 뿌리줄기에서 13C/12C의 비율이 비수유 처리에서보다 유의하게 높았다. 비수유 처리와 비교했을 때, 잎 및 줄기-혈관-다발 수유 처리에서 잎의 PS VII 분자(M+2) –/M−의 비율이 크게 증가했습니다. 동시에, 비수유 처리와 비교하여, 뿌리줄기 처리 하의 잎에서 PS VII 분자(M+2) –/M−의 비율은 유의한 차이를 보이지 않았습니다. 또한, 줄기, 뿌리 및 뿌리 줄기에서 PS VII 분자 (M + 2) − / M −의 비율은 4 가지 처리간에 차이를 보이지 않았습니다. 비수유 처리와 비교했을 때, 잎 수유 처리 하의 잎에서 파리 사포닌 II(PS II) 분자 (M+2) −/M−의 비율은 유의한 차이를 보이지 않았으며, 잎 수유 처리 하의 잎에서 PS II 분자의 (M+3) −/M− 비율은 더 낮았다. 이 데이터는 PS VII의 합성을 위한 주요 기관이 잎이라는 것을 확인했다. 이는 약용 식물에서 2차 대사 산물의 합성에 관여하는 1차 기관 및 경로를 향후 식별하기 위한 토대를 마련합니다.
Introduction
식물에서 2차 대사 산물의 생합성 경로는 매우 특이적이고 다양한 축적 기관을 포함하여 복잡하고 다양합니다1. 현재 많은 약용 식물에서 2차 대사 산물에 대한 특정 합성 부위와 책임 기관은 잘 정의되어 있지 않습니다. 이러한 모호성은 의약 재료의 수확량과 품질을 모두 최적화하도록 설계된 재배 방법의 전략적 발전과 구현에 심각한 장애물이 됩니다.
분자 생물학, 생화학 및 동위원소 표지 기술은 약용 식물 2,3,4,5에서 2 차 대사 산물의 합성 경로 및 위치를 밝히기 위해 광범위하게 사용되며, 이러한 각 방법론은 효율성 및 정확성의 차이와 같은 고유 한 강점과 한계를 나타냅니다. 예를 들어, 분자 생물학 접근법은 생합성 경로 내의 위치를 정확히 찾아내는 데 높은 정밀도를 제공하지만 특히 시간이 많이 걸립니다. 이들의 유용성은 공개적으로 이용 가능한 게놈 염기서열이 없는 종에 대해 더욱 제한되며, 이러한 경우에는 이러한 기술의 실행 가능성을 떨어뜨린다6. 대조적으로, 3C/12C, 2H/1H 및 18O/16O와 같은 동위원소 비율을 사용하는 동위원소 표지 기술은 2차 대사 산물 7,8의 합성, 수송 및 저장 메커니즘을 조사할 수 있는 빠르고 접근 가능한 수단을 제공합니다. 그들은 잎에 있는 유기 화합물과 안정 동위원소의 공간적 분포를 밝힐 수 있으며, 이를 통해 잎이 수명주기 동안 경험하는 환경 조건을 재구성할 수 있다9. 또한, 13C 6-Glucose10 및 13C 6-Phenylalanine 11과 같은 외부 동위원소 표지의 적용은 탄소 표지된 2차 대사 산물의 생성을 가능하게 하여 그들의 생산 및 기능에 대한 이해를 향상시킵니다.
기존의 탄소 동위원소 표지 기법은 생합성 경로와 수송 메커니즘의 매우 종 특이적인 특성으로 인해 2차 대사산물의 합성을 담당하는 특정 장기를 정확히 찾아내는 데 어려움을 겪습니다. 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)은 이 분야에서 중추적인 분석 기기로 두각을 나타내고 있으며, 약물의 화학적 합성에서 외인성 동위원소를 추적하고 흡수, 분포, 대사 및 배설과 같은 생체 내 과정을 조사하기 위한 강력한 방법을 제공합니다12. LC-MS의 우수한 감도, 직설성 및 신뢰성은 식물13에서 2차 대사 산물의 생성을 모니터링하는 데 이상적인 선택입니다. 최근 LC-MS는 다양한 샘플에 대한 라벨링 효율성을 평가할 수 있는 외부 동위원소 라벨링 기술에 적용하기 위해 점점 더 선호되고 있습니다. 이 방법론은 약용 식물에서 2차 대사 산물의 합성에 관여하는 1차 기관에 대한 중요한 통찰력을 제공하며, 이러한 화합물14,15의 합성 기관을 식별하기 위한 생물학적 방법에 대한 귀중한 보완 자료 역할을 합니다. 결과적으로, 이 접근법은 다양한 표본 간의 라벨링 효율성 비교를 용이하게 할 뿐만 아니라 식물 2차 대사 산물의 생성과 관련된 주요 장기를 밝혀 생합성에 대한 이해를 향상시킵니다.
탄소 동위원소 라벨링과 LC-MS 검출을 결합하여 약용 식물에서 2차 대사 산물을 합성하는 1차 장기를 식별하는 새로운 방법을 도입했습니다. 파리 사포닌(Paris saponin, PS)은 항암, 면역조절, 항염증 등의 다양한 약리작용을 하며16 PPY에 대한 수요가 증가하고 있다17. 따라서 우리는 PPY 묘목을 연구 주제로 사용하고 LC-MS 방법과 관련된 13C6-Glucose 라벨링을 사용하여 파리 사포닌 VII (PS VII) (그림 1B)를 합성하는 주요 기관이 잎이라는 것을 해독했습니다. 우리의 접근법에는 잎, 뿌리줄기 및 줄기-혈관 다발에 13C 6-Glucose 공급과 비급여 대조군을 포함하는 4가지 다른 치료법이 포함되었습니다. 13C 6-Glucose의 선택은 호흡을 통해 아세틸 코엔자임 A로 신속하게 대사 된 다음 PS 합성을 촉진하기 때문에 전략적입니다. 13C의 풍부한 자연량을 활용하여 가스 크로마토그래피 안정 동위원소 비율 질량 분석기(GC-IRMS) 시스템을 활용하여 다양한 식물 기관에서 13C/12C비율을 평가하고 PS VII 및 파리 사포닌 II(PS II)(그림 1B) 분자의 동위원소 이온 피크 비율을 분석했습니다. 13개의 C 라벨링 식물 2차 대사산물 전구체와 최첨단 질량 분석 기술을 활용하는 당사의 방법론은 기존 탄소 동위원소 라벨링 방법에 대한 더 간단하고 정확한 대안을 제공합니다. 이 새로운 접근법은 약용 식물의 2차 대사 산물 합성에 관여하는 장기에 대한 이해를 심화시킬 뿐만 아니라 이러한 화합물의 생합성 경로에 대한 향후 탐구를 위한 견고한 토대를 마련합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 성공적인 구현은 식물의 생리학적 특성, 조직, 장기 및 2차 대사 산물에 대한 포괄적인 연구에 달려 있습니다. 프로토콜에 요약된 실험 설계 접근법은 식물 2차 대사 산물의 생합성 경로를 조사하기 위한 강력한 토대를 마련합니다. 이 실험에서 중요한 요소는 (1) 다년생 묘목의 나이를 결정하고 (2) 올바른 동위원소 라벨링 검출 타이밍을 선택하는 것입니다. 약용 식물은 다년생 식물…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단의 청소년 프로그램 (No. 82304670)의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.1 % Formic acid water | Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory | 44890 | |
| 13C6-Glucose powder | MERCK | 110187-42-3 | |
| Acetonitrile | Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory | 44890 | |
| AUTOSAMPLER VIALS | Biosharp Biotechnology Company | 44866 | |
| BEH C18 column | Waters,Milfor,MA | 1.7μm,2.1*100 mm | |
| CNC ultrasonic cleaner | Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd | KQ-600DE | |
| Compound DiscovererTM software | Thermo Scientific, Fremont,CA | 3 | |
| Compound DiscovererTM software | Thermo Scientific,Fremont,CA | 3 | |
| Electric constant temperature blast drying oven | DHG-9146A | ||
| Electronic analytical balance | Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd | SOP | |
| Ethanol | Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory | 44955 | |
| Fully automatic sample rapid grinder | Shanghai Jingxin Technology | Tissuelyser-48 | |
| Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer | Thermo Fisher | Delta V Advantage | |
| Hoagland solution | Sigma-Aldrich | H2295-1L | |
| Hydroponic tank | JRD | 1020421 | |
| Isodat software | Thermo Fisher Scientific | 3 | |
| Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry | Agilent Technology | Agilent 1260 -6120 | |
| Nitrogen manufacturing instrument | PEAK SCIENTIFIC | Genius SQ 24 | |
| Organic phase filter | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | 44890 | |
| Oxygen pump | Magic Dragon | MFL | |
| Quantum sensor | Highpoint | UPRtek | |
| Scalpel | Handskit | 11-23 | |
| Sprinkling can | CHUSHI | WJ-001 | |
| Xcalibur software | Thermo Fisher Scientific | 4.2 |
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