SPE-UPLC による 1 つのピーナッツ中のアフラトキシンおよびスチルベノイド植物アレキシンの非破壊定量(英語 )種子

1.真菌チャレンジのための種子の準備 アフラトキシゲン Aspergillus flavus NRRL 3357を、試験管内のジャガイモデキストロース寒天培地(PDA)の傾斜に30°Cで6日間インキュベートします。 試験管から10 mLの水とTween 20(蒸留滅菌水1 Lに100 μLのTween)を入れて真菌胞子を採取し、漏斗に入れたグラスウールでろ過し、ユーザーマニュアルを参照して血球計算盤で胞子をカウントします。 胞子懸濁液を滅菌水で1,000胞子/μLの濃度に希釈します。血球計算盤で濃度を確認します。注:困難な実験の2時間前までに胞子懸濁液を準備します。 ピーナッツのさやをそっと割って、外皮を取り除きます。種子の量がビーカーの体積の1/5を超えないように種子を滅菌ビーカーに入れ、ビーカーの容量の約0.05%に過酸化水素溶液を70%加え、種子が水を3時間吸収するのを待ちます。 種子から過酸化水素溶液をデカントし、ビーカーに約3倍の量の80%エタノール-水混合物(v / v)を加えて種子を覆います。1分間放置してから、等量の滅菌蒸留水で種子を2回すすぎます。 エタノール滅菌した種子と一緒にビーカーに5倍の容量の3%過酸化水素を加え、5分間放置してから、液体をデカントし、等量の滅菌水で種子を2回すすぎます(図2A)。 図2:アフラトキシンおよびフィトアレキシン画分の接種、インキュベーション、および抽出のためのピーナッツ種子の調製(A)3%過酸化水素による吸収種子の滅菌;(B)種子から精巣(皮膚)を除去するステップと、(c)胚軸部分を切り取り、(D、E)ドリルビットを備えた半分の子葉の穴あけキャビティ。(f)種子の穿孔部分を寒天上に置くこと。(g)穿孔された空洞に真菌胞子を塗布する。(H)インキュベーション後の種子を含むペトリ皿。(I)インキュベートした単一種子(対照試料の写真)を強化しビーズチューブに入れるステップと、(j)測定された量の抽出溶媒を添加し、(k)ビーズラプターでサンプルを粉砕し、(L)粉砕されたスラリーの遠心分離。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 滅菌ペーパータオルの上に種子を置き、鉗子で種子精巣を取り除き、メスで胚軸を含む種子の約1/3を切り取ります(図2B、C)。 種子のこの部分を廃棄するか、成長培地を使用して試験管で植物を育てます(図1B、E)。 種子の残りの部分を2つの子葉に分け、それらをペトリ皿に入れ、種子の部分を湿った滅菌濾紙で覆い、脱水を避けるために蓋を元に戻し、すぐに接種ステップに進みます。 困難な実験を行う前に、100 x 15 mmのディッシュに1.5%滅菌寒天を26 mLの水に注ぎ、一晩固化させて、シードインキュベーション培地で十分な数のペトリ皿を準備します。 残りの各子葉の外側の中央に、直径1.6〜2.34mmの滅菌鋭利なドリルビットで種子を手動で穴を開けて、1.5〜2mmの深さの空洞を作ります。空洞を作るのに ~2 秒から 5 秒かかります (図 2D、E)。 4〜6個の「穴あけ」した種子片を寒天の入ったシャーレに入れ、10μLのピペッターで各半子葉片の穴あけキャビティに1,000胞子/μLの懸濁液2μLを塗布します。胞子懸濁液の代わりに、対照種子に滅菌水を適用します(図2F、G)。 すべてのシャーレに蓋をして、光なしで30°Cで72時間インキュベートします。 2. アフラトキシンおよびフィトアレキシン分析のためのインキュベート種子片のサンプリングと調製 鉗子で寒天から種子片を取り出し、13個のジルコニウムセラミックビーズ(直径2.8 mmの12個と直径6.5 mmの1個)を入れたラベル付き7 mLビーズバイアルにそれぞれを入れて、72時間で種子片を収集します(図2H、I)。注:この時点で、すぐに処理しない場合は、バイアルを-80°Cの冷凍庫に入れ、最大2か月間保管してからさらに処理することができます。 フィトアレキシンとアフラトキシンは、同じ種子抽出物で測定されます。抽出には、視覚的なシードサイズ(小、中、大)に応じて、正確に測定した2 mLまたは4 mLのメタノール-水混合物(90:10、v / v)をビーズバイアルに加え、5.5 m / secで45秒間粉砕します。粉砕した種子を入れたバイアルを遠心分離機に入れ、1,860 × gで3分間遠心分離します(図2J-L)。注:次の重要な17,22スチルベノイド誘導体が決定されます（すべてトランス配置で）レスベラトロール、アラチジン-1、アラチジン-2、アラキジン-3、3′-イソペンタジエニル-3,5,4′-トリヒドロキシスチルベン(IPD)、およびSB-1。 アフラトキシン分析では、困難な実験を実行する前に、次のように十分な数のクリーンアップカラムを準備します。90°角にカットしたガラスロッドを使用して、対応するポリエチレン多孔質(20 μL)フリットを1.5 mLポリプロピレンカラムに入れます。カスタムメイドのスコップで50 mgのマグネシウムシリカゲル(100〜200メッシュ)をカラムに入れ、ガラス棒で押し下げて同じフリットでカラムをキャップします(図3A-E)。注:この量のマグネシウムシリカゲルは75μLの容量を占め、吸着剤層の高さは3mmです。 図3:クリーンアップカラムとフィルターの準備(A、B)多孔質フリットをバレルに入れる。(C、D)マグネシウムシリカゲルをバレルに充填します。(E)吸着剤を梱包し、上部多孔質フリットをバレルに挿入します。(F)パスツールピペットの上に直径11.5mmのガラス繊維円を置きます。(G,H)プラスチックまたは木製の棒で円の中心をパスツールピペットバレルの底まで押し下げ、ガラス繊維をしっかりと圧縮します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 この時点で、図3F-Hに示すように、同じ数のカスタムメイドフィルターを準備します。 アフラトキシン分析では、上清(ステップ2.2で説明して得られたもの)を最大0.5 mLアリコートまで正確に測定し、カスタムパックされたミニカラムに移し、抽出物を重力によって4 mLガラスバイアルに排出します。1.0 mL のメタノール-水(90:10、v/v)混合物をカラムに移し、重力によって不純物を同じ 4 mL バイアルに洗い流します(図 4A)。 図4:種子抽出物の精製とUPLC分析の準備。 (A)パックされたカラムを備えたラック。 (B)クリーンアップカラムから溶出した精製抽出物を含む6つの4mLバイアルからN2 ガスで溶媒を蒸発させます。(C)4 mLバイアルに注入溶媒(MeOH-H2O 9:1、v / v)を添加する前後に、氷を入れた発泡容器(1および2)内でバイアルとフィルターを氷点下の温度にします。(D)4 mLバイアルから冷却した抽出物を400 μLオートサンプラーバイアルにろ過します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 組み合わせた溶出液を廃棄します。カラムから重力によりアフラトキシン画分を、1.2 mL アセトン-アセトニトリル-水-88% ギ酸(65:31:3.5:0.5、v/v)混合物(図 4A)を含む清浄な 4 mL ガラスバイアルに溶出します。 あるいは、2.0 mL のアセトニトリル-水-88% ギ酸(96:3.5:0.5、v/v)混合物でカラムからアフラトキシンを溶出し、溶出液のアリコートを最大 2 μL まで超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)システムに直接注入します(溶媒を N2 で蒸発させません)。注:この場合、アフラトキシンの定量限界は最大10倍下限となることが予想されます。ほとんどの場合、チャレンジされた種子のアフラトキシン濃度が高いことが多いため、このような感度の低下は許容されます。 バイアルから溶媒を、45°Cの加熱ブロック内でN2 の流れで取り出します。 バイアルにキャップをし、砕いた氷を入れた容器に30〜45秒間入れて、次のステップで追加する溶媒の蒸発を最小限に抑えます。カスタムメイドのフィルターを使い捨ての試験管に入れ、ろ過時の溶媒の蒸発を最小限に抑えるために、チューブを別の容器の氷に挿入します(図4B、C)。 溶媒の蒸発後、乾燥残渣を正確に測定した0.25〜1.0 mLのメタノール-水混合物(90:10、v / v)に溶解し、渦巻き1〜2秒間加熱します。精製した抽出物を入れたバイアルをUPLCオートサンプラーに入れ、0.1〜3.0 μLをUPLCシステムに注入します(図5A、B)。注意: ボルテックス後の溶液に浮遊粒子が含まれている疑いがある場合は、冷却されたフィルターで溶液をろ過します(図4D)。 図5:精製抽出物のUPLC分析のプロセスと結果 (A)精製サンプル抽出物の入ったラックをUPLCオートサンプラーにセット。(B)機器分析の実施、データの取得、および結果の解釈。(C)4つの主要なアフラトキシンのUPLC。関心のある主要なピークであるアフラトキシン B1 と B2 は、それぞれ 0.04 ng と 0.004 ng を表します。(D)アフラトキシンB1 およびB2のUPLC。ピーク 2 は、2 pg レベルのアフラトキシン B1 を表します(8 μL フローセルを使用)。(E)野生の アラキス 種を含む地元のピーナッツ畑から収穫された種子の精製抽出物のUPLC。(F)塩基性酸化アルミニウムミニカラムで精製したチャレンジドピーナッツ種子の抽出物のUPLC。(G)Florisilカラムで精製したチャレンジドピーナッツ種子の抽出物のUPLC。青色のクロマトグラムは、1 mL のメタノール-水(90:10 v/v)混合物でカラムから洗浄された不純物を示しています。黒色のクロマトグラムは、アフラトキシン M1 と B1 のピークを示しています。アフラトキシンB1 のレベルは48 ng/gである。略語:IPD = 3′-イソペンタジエニル-3,5,4′-トリヒドロキシスチルベン。注:種子抽出物中のすべてのスチルベノイドは トランス配置されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。  フィトアレキシン分析では、各ビーズバイアルから200 μLの上清を上記のパスツールピペットフィルターに移します。圧縮窒素タンクからのN2 ガスを使用して、400 μL UPLCオートサンプラーバイアルへのろ過を促進し、PTFEセプタム(図4D)のキャップでバイアルをキャップします。 3. アフラトキシン分析 種子抽出物中のアフラトキシンの分離には、オートサンプラー、クオータナリーポンプ、蛍光検出器、UPLC BEH C18 3.0 mm x 100 mm、1.7 μm カラムとマッチングプレカラム、および標準ニット PTFE コイル内径 0.25 を元の長さの 25% にカットしたポストカラム光化学反応器(PHRED)を備えた UPLC システムを使用します。注:著者らが使用した UPLC 装置および関連装置は、 資料表に記載されています。 初期条件、62.7% A、24% B、13.3% C、3.75 分で 30% A、45% B、25% C に直線的に変化し、3.751 分で 0% A、64.4% B、35.6% C に変化し、3.751 分で 0% A、64.4% B、35.6% C に変化し、アイソクラティックを 3.249 分間保持し、その後 0.01 分で初期条件に変更し、次の注入前にアイソクラティックを 2.499 分間保持しました。流速を 0.45 mL/min、実行時間を 9.5 分に設定します。システムカラムヒーター内でカラムを40°Cに保ちます。アフラトキシン B1、B2、G1、G2、M1 の定量には、それぞれ 362 nm と 440 nm を励起波長と発光波長として使用します。主要なアフラトキシンの構造を 図6Aに示します。注:実験条件下では、アフラトキシンB1 およびB2 のみが A. flavus NRRL 3357によって産生されると予想されます。 A. parasiticus 株を種子挑戦に用いる場合、アフラトキシンB1、B2、G1、G2 の産生が予想されます。 アフラトキシンの濃度は、ソフトウェアのユーザーマニュアルに記載されているように、対応する真正標準試料のピーク面積(検量線)を参照して測定します。注:UPLCの手順では、蛍光検出器の高感度設定でベースラインノイズが現れるため、アフラトキシンの検出限界(LOD)および定量限界(LOQ)は、広く受け入れられているシグナル対ノイズ比であるLODが3:1、LOQが10:1という広く受け入れられているS/N比を使用して評価されます。セクション 2 と 3 で説明するピーナッツ種子分析のルーチン実験セットアップでは、アフラトキシン G1 と B1 の定量限界は、アフラトキシン G2 と B2 でそれぞれ 0.8 ng/g と 0.08 ng/g 以下になると予想されます。 4. スチルベノイドフィトアレキシン分析 スチルベノイドの分離には、水(A)、メタノール(B)、88% ギ酸(C)を次のグラジエントで使用します:初期条件、53% A、42% B、5% C、2.0 分で 35% A、60% B、5% C に直線的に変化、4 分間アイソクラティックに保持、0% A、95% B、5% C に 0.5 分間、アイソクラティックに 2.5 分間保持、 その後、0.1分で初期条件に変更し、次の注射の前に2.9分間アイソクラティックを保持しました。流速を 0.5 mL/分、実行時間を 12.0 分に設定します。 スチルベノイドの濃度は、対応する真正標準試料のピーク面積(検量線)および/またはソフトウェアのユーザーマニュアルに記載されている公表されているモル吸光係数を参照して決定します。主要なスチルベン由来フィトアレキシンの構造を 図6Bに示します。注:フィトアレキシンの分離は、同じシステムを使用して行われますが、蛍光検出器とPHREDリアクターはありません。代わりに、ダイオードアレイ検出器を使用して、ピーナッツスチルベノイドの検出と定量を行います。主要なスチルベノイド植物性アレキシンの定量限界(LOQ)は、スチルベノイド濃度が同じ抽出物中のアフラトキシンの濃度を数桁上回るため、実用的な意味を持ちません。3日間のインキュベーション後、スチルベノイドは確実に定量されます。