박출률이 보존된 고지혈증 유발 심부전의 쥐 모델

동물 프로토콜은 미국 국립보건원(NIH) 지침(IACUC 프로토콜 23-103-ad03)에 따라 마이애미 대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 본 연구를 위해 129J 배경의 야생형(WT) 마우스를 상업적 출처( 재료 표 참조)에서 획득하고 사내에서 사육했습니다. 모든 쥐는 129J 배경에서 새끼 동물이었습니다. 실험에는 수컷과 암컷 쥐가 모두 포함되었습니다. LDLR/P-407 HFpEF 마우스는 첫째 주에 AAV9-cTnT-LDLR을 1회 투여하고 4주 동안 격주로 p407을 투여함으로써 확립되었습니다. 1. AAV9-cTnT-LDLR 준비 및 관리 참고: AAV9-cTNT-hLDLR 플라스미드( 재료 표 참조)는 전체 인간 LDLR 단백질(2664bp)을 암호화합니다(그림 1). AAV-LDLR 바이러스 벡터 전처리동물의 수에 따라 AAV9 스톡 바이알을 얼음에서 20분 동안 해동한 다음 AAV 입자를 Dulbecco의 DPBS(Phosphate Buffered Saline)에 희석하여 100μL에서 1 x 1012 벡터 게놈/마우스의 농도를 얻습니다. 바이러스 용액을 1mL 주사기의 28-30G 바늘에 넣습니다. 바늘에 기포가 들어가지 않도록 주의하십시오. 정맥 주사(i.v.) 꼬리 정맥 주사 절차최대 0.5L/min의 산소를 켜고 이소플루란 마취 시스템을 4%-5%로 설정합니다. 동물이 반응하지 않을 때까지 마우스를 유도 챔버에 ~2분 동안 넣습니다. 동물을 쥐 꼬리 조명 장치 조절기(예: Braintree Scientific, Inc.(Braintree, MA))에 놓고 동물을 옆으로 누울 수 있습니다. 유지 보수를 위해 이소플루란 마취를 2%-3%까지 사용하십시오.알림: 억제 장치에 의한 가열은 생쥐 꼬리 정맥의 팽창을 유발하여 주입을 훨씬 쉽게 만듭니다. 측면 꼬리 정맥을 식별합니다. 거즈 패드를 사용하여 소독약으로 주사 부위를 청소하십시오. 꼬리 끝을 잡고 뻗고 정맥이 보일 때까지 손가락으로 쥐 꼬리를 마사지합니다. 바늘을 낮은 각도(10-15도 각도)로 삽입하고 희석된 AAV 100μL를 꼬리 정맥에 주입합니다(그림 2A). 바늘을 빼내고 출혈이 멈출 때까지 즉시 손가락으로 압력을 가하십시오. 마우스를 원래 케이지로 되돌립니다. 2. P-407 준비 및 관리 P-407 준비P-407 제제( 재료 표 참조)를 DPBS로 희석하여 흄 후드 내부의 최종 농도 100mg/mL로 용액을 준비합니다. P-40710의 용해를 용이하게 하기 위해 로테이터에서 용액을 4°C에서 밤새 냉장 보관합니다. 격주 복강내(i.p.) 주사 절차i.p. 주사 첫날에 각 마우스의 무게를 잰다. 1g/kg 공식을 사용하여 무게와 프리필 주사기에 따라 각 마우스에 대한 적절한 투여량을 계산합니다. 흄 후드 아래에서 머리와 몸을 아래쪽으로 기울인 상태에서 마우스를 수동으로 고정하여 내부 장기를 두개골 위치로 재배치합니다. 이 기술은 주변의 중요한 구조물에 구멍이 뚫리는 것을 방지합니다. 정중선 측면의 복부 하부 사분면에 있는 왼쪽 복막강을 식별합니다. 방부제로 현장을 청소하십시오. 45도 이하의 각도로 바늘을 복막강에 삽입합니다(그림 2B). 주사기가 적절하게 삽입되도록 흡입합니다. 흡인에 혈액이나 조직이 있는 경우 바늘을 빼내고 주사기가 깨끗해질 때까지 2.2.2-2.2.4단계를 반복합니다. 바늘을 적절한 날카로운 물건 용기에 버리고 마우스를 원래 케이지로 되돌립니다. 3. 심장 초음파 검사 준비촬영 전날 또는 촬영 몇 시간 전에 쥐의 가슴과 상복부에 제모 크림을 바릅니다. 2분 후 젖은 거즈로 크림을 제거합니다. 0.8L/min 유속에서 2.5%-3.0% 이소플루란으로 마우스를 마취하고 1%-1.5% 이소플루란으로 유지합니다. 그런 다음 전도성 젤로 전극 패드에 발을 대고 누운 자세의 적절한 플랫폼에 마우스를 고정하고 코와 입을 노즈 콘으로 덮어 이소플루란으로 지속적인 마취를 보장합니다. Parasternal 장축 보기마우스를 똑바로 놓은 상태에서 플랫폼의 오른쪽을 45도 기울입니다. 다음으로, 레일 시스템에서 트랜스듀서 프로브를 대각선으로 정렬하고 오른쪽 상단에서 왼쪽 복부까지 시계 방향으로 30-40도 각도를 조절하여 B 모드 이미지를 얻고 저장합니다. 초음파 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 B 모드 이미지를 분석하여 박출 분율을 얻습니다(그림 3A). Parasternal short-axis view레일 시스템의 트랜스듀서 프로브를 시계 방향으로 90도 회전하여 B 모드 및 M 모드 이미지를 얻고 저장합니다. 정점 보기플랫폼의 왼쪽 상단 모서리를 아래쪽과 오른쪽으로 기울입니다. 변환기를 동물의 오른쪽 어깨 쪽으로 향하게 합니다. B-모드와 컬러 도플러 모드에서 승모판을 시각화합니다. 펄스파(PW) 도플러 및 조직 도플러 영상 획득및 저장 5. 초음파 분석 소프트웨어를 사용하여 PW 도플러 및 조직 도플러 이미지를 분석하여 IVRT, E/E’ 및 E/A를 얻습니다(그림 3B-E). 4. 압력-부피(PV) 루프 데이터 기록 연구가 끝나면 이전에 설명한 절차11,12에 따라 좌심실(LV) 수축기 및 이완기 기능을 평가하기 위해 혈류역학 분석을 수행합니다.마우스에 이소플루란(3-5%, 유도 챔버)을 유도하는 것으로 시작합니다. 마취 작용이 시작되면 동물을 수술대로 옮기고 이소플루란(1-3%, 안면 마스크)으로 마취를 유지합니다. 기관 내 삽관(입을 통해)을 할 수 있도록 목 위의 피부를 약간 절개합니다. ~0.15-0.2mL 부피로 설정된 설치류 인공호흡기(예: Micro vent 모델 848, Harvard Apparatus)를 사용하여 산소와 이소플루란의 혼합물로 동물을 환기시킵니다. 온도 조절이 가능한 수술 테이블을 사용하여 절차 전반에 걸쳐 ~37°C ± 1°C에서 체온을 모니터링합니다. 유체 지원 투여를 위해 30G 바늘로 왼쪽 내부 경정맥을 노출시키고 캐뉼레이팅합니다. 정중 복부 경부 부위의 피부를 자르고 경동맥을 노출시킵니다. 우경동맥의 원위부 폐색 후 동맥을 약간 절개하여 좌심실(폐쇄 흉부 접근법)에 micro-tipped pressure-volume (PV) 카테터( 재료 표 참조)를 도입할 수 있도록 합니다. 정상 상태 및 하대정맥 폐색 중 PV 루프를 기록합니다. 실험이 끝나면 승인된 AVMA 방법(예: 이소플루란 후 자궁 경부 탈구)을 사용하여 동물을 인도적으로 안락사시킵니다(깊은 마취 하에). LabChart 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 PV 데이터를 분석하고 심초음파 측정을 사용하여 부피를 보정합니다.