얇아진 두개골 창과 유체 타악기를 통합한 반복적인 경미한 외상성 뇌 손상의 수정된 마우스 모델
Summary
이 프로토콜은 폐쇄성 두부 손상(CHI) 방법을 통해 유도된 반복적인 경미한 외상성 뇌 손상(rmTBI)의 수정된 마우스 모델을 제시합니다. 이 접근법은 두개골 창과 유체 타악기를 사용하여 수막 노출로 인해 일반적으로 발생하는 염증을 줄이고 설치류의 rmTBI 모델링에서 재현성 및 정확도를 향상시킵니다.
Abstract
경미한 외상성 뇌 손상은 임상적으로 매우 이질적인 신경 장애입니다. 경증 TBI 후 신경병리학의 기전을 연구하고 치료제를 테스트하기 위해 잘 정의된 병리학을 가진 재현성이 높은 외상성 뇌손상(TBI) 동물 모델이 시급히 필요합니다. 동물 모델에서 TBI의 전체 후유증을 복제하는 것은 어려운 일임이 입증되었습니다. 따라서 TBI 환자에서 볼 수 있는 다양한 측면과 중증도를 설명하기 위해 TBI의 여러 동물 모델을 사용할 수 있어야 합니다. CHI는 rmTBI의 설치류 모델을 제작하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 그러나 이 방법은 사용된 충격 방법, 두개골 뼈의 두께와 모양, 동물 무호흡증, 사용된 머리 지지대 및 고정 유형 등 여러 요인에 취약합니다. 이 프로토콜의 목적은 얇은 두개골 창과 FPI(Fluid Percussion Injury) 방법의 조합을 시연하여 CHI 관련 rmTBI의 정확한 마우스 모델을 생성하는 것입니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 두개골 두께, 모양 및 머리 지지대를 포함하여 CHI 및 FPI 모델링의 정확성과 일관성에 영향을 줄 수 있는 요인을 최소화하는 것입니다. 얇은 두개골 창 방법을 활용함으로써 개두술 및 FPI로 인한 잠재적 염증을 최소화하여 경증 TBI 환자에서 관찰된 임상적 특징을 복제하는 개선된 마우스 모델을 얻을 수 있습니다. 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin, HE) 염색을 사용한 행동 및 조직학적 분석 결과는 rmTBI가 뇌의 행동과 총체적 형태 모두에 변화를 일으키는 누적 손상으로 이어질 수 있음을 시사합니다. 전반적으로, 변형된 CHI 관련 rmTBI는 연구자들이 rmTBI의 초점 및 미만성 병태생리학적 변화에 기여하는 기본 메커니즘을 탐구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
Introduction
뇌진탕 및 준뇌진탕을 포함한 경증 TBI는 모든 TBI 사례의 대부분을 차지합니다(전체 TBI의 >80%)1. 경증 TBI는 일반적으로 낙상, 교통사고, 폭력 행위, 접촉 스포츠(예: 축구, 복싱, 하키) 및 군사 전투에 의해 발생한다 2,3. 경증 TBI는 환자의 일생 동안 신경 행동 기능에 영향을 미치고 신경 퇴행성 질환의 위험을 증가시키는 신경 생물학적 사건으로 이어질 수 있습니다 4,5,6. 동물 모델은 경증 TBI를 연구할 수 있는 효율적이고 통제된 수단을 제공하며, 경증 TBI의 진단 및 치료를 더욱 향상시킬 수 있기를 희망합니다. 경증 TBI에 대한 다양한 모델이 개발되었는데, 예를 들어 CCI(Controlled Cortical Impact), WD(Weight Drop), FPI(Fluid Percussion Injury) 및 blast-TBI 모델 7,8이 있다. 단일 실험 모델은 TBI 유발 병리학 9,10의 전체 복잡성을 모방할 수 없습니다. 이러한 모델의 이질성은 경증 TBI 환자와 관련된 다양한 특징을 다루고 해당 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 데 유리합니다. 그러나 TBI의 각 동물 모델에는 한계가 있으며3 이는 동물 경증 TBI에 대한 현재의 지식과 그 임상적 타당성을 제한한다.
WD 및 CCI 모델은 뇌 조직 손실, 급성 경막하 혈종, 축삭 손상, 뇌진탕, 혈액-뇌 장벽 기능 장애 및 TBI 3,11,12에 따른 혼수와 같은 임상 상태를 복제하는 데 사용됩니다. WD 모델은 자유롭게 떨어지는 추로 경막이나 두개골을 쳐서 뇌 손상을 유도하는 것을 포함합니다. 무게가 가해진 물체가 온전한 두개골에 가해지는 충격은 혼합된 초점/미만 부상을 재현할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 부상 부위의 낮은 정확도 및 반복성, 반동 부상 및 두개골 골절로 인한 높은 사망률과 관련이 있습니다 3,11,12. CCI 모델은 공기 구동 금속을 적용하여 노출된 경막에 직접 충격을 가하는 것을 포함합니다. WD 모델과 비교하여, CCI 모델은 보다 정확하고 재현 가능하지만, 충격 팁(11)의 직경이 작기 때문에 확산성 부상을 일으키지 않는다. FPI 모델링 중에 뇌 조직은 충격에 의해 잠시 변위되고 변형됩니다. FPI는 혼합성 국소/미만성 손상을 유발할 수 있으며 TBI 후 두개내 출혈, 뇌 부종 및 진행성 회백질 손상을 복제할 수 있습니다. 그러나 FPI는 뇌간 손상과 장기간의 무호흡증으로 인해 사망률이 높습니다 3,12. 기존의 WD, CCI 및 FPI 모델에 포함된 개두술은 대뇌 피질 타박상, 출혈성 병변, 혈액-뇌 장벽 손상, 면역 세포 침윤, 신경교세포 활성화, 모델링 시간 연장 및 치명적인 결과를 초래할 수 있습니다 3,12.
경증 TBI는 GCS(Glasgow coma scale, GCS) 점수가 13에서 15 사이의 범위를 특징으로 합니다2. 경증 TBI는 국소 또는 미만성일 수 있으며 세포 항상성 파괴, 흥분독성, 포도당 고갈, 미토콘드리아 기능 장애, 혈류 장애 및 축삭 손상과 같은 급성 손상뿐만 아니라 축삭 손상, 신경 염증 및 신경교증을 포함한 아급성 손상과 관련이 있습니다 2,3. TBI의 복잡한 병태생리학을 설명하는 데 상당한 진전이 있었음에도 불구하고, 경증 TBI/rmTBI의 기전은 여전히 파악하기 어려우며 추가 연구가 필요하다9. CHI가 TBI(12)의 가장 흔한 유형이라는 점을 감안할 때, 이 프로토콜은 얇아진 두개골 창(13)에 충격을 가하기 위해 수정된 FPI 장치를 사용하여 보다 정밀하게 제어되는 rmTBI의 마우스 모델을 생성하는 새로운 접근법을 제시한다. 이 접근 방식은 개두술로 인한 부상, 다양한 두개골 두께 및 모양으로 인한 부정확성, 반동 부상을 방지함으로써 WD, CCI 및 FPI 모델과 관련된 주요 단점을 극복하는 것을 목표로 합니다. 얇아진 두개골 창에 FPI 충격을 가하면 rmTBI 후 뇌혈관 손상을 평가하는 데 편리하며 일부 모델에서 높은 사망률을 최소화하는 데 도움이 되어 TBI 환자의 임상적 특징과 더 유사합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TBI는 폐쇄형과 관통성의 두 가지 주요 유형을 말하며, 후자는 두개골과 경막의 파괴를 특징으로 합니다. 임상 데이터에 따르면 CHI는 관통 부상보다 더 흔합니다 1,2. 한 번의 경미한 TBI 후유증 후, 대부분의 환자는 일반적으로 단기간에 해결되는 PCS 증상을 경험하며, PCS가 장기 후유증으로 발전하는 환자의 비율에 대해서는 논란이 있다23,24<…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 진화시 중점사회발전재단(제2020-3-071호), 저장대학생 혁신 및 기업가정신 훈련 프로그램(제S202310345087, S202310345088호), 저장성대 학생 과학기술혁신 활동 계획 프로젝트(제2023R404044호)의 지원을 받았다. 저자들은 이 논문의 언어 편집을 해준 Miss Emma Ouyang(미국 볼티모어 존스 홉킨스 대학교 1학년 학생, 이학사)에게 감사를 표한다.
Materials
| 75% ethanol | Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd. | 220502 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd | H12020272 | Solution, Analgesic |
| Carprofen | Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd | 53716-49-7 | Powder, Analgesic |
| Chlorhexidine digluconate | Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd. | 18472-51-0 | 19%-21% aqueous solution, Antimicrobial |
| Dental cement and solvent kit | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. | 20220405, 3# | Powder reconsituted in matching solvent |
| Dissecting microscope | Shenzhen RWD Life Science Inc. | 77019 | |
| Erythromycin ointment | Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd. | 220412 | Antibiotic |
| Fiber Optic Cold Light Source | Shenzhen RWD Life Science Inc. | F-150C | |
| Flat-tipped micro-drill bit | Shenzhen RWD Life Science Inc. | HM31008 | 2 mm, steel |
| FPI device software | Jiaxing Bocom Biotech Inc. | Biocom Animal Brain Impactor V1.0 | |
| ICR mice | Jinhua Laboratory Animal Center | Stock#2023091 | 25 Male mice, 25-30g, 8 weeks old |
| Isoflurane | Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd. | 2023090501 | |
| Isothermal heating pad | Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd. | ||
| Luer Loc hup | Custom made using a 19G needle hub | ||
| Micro hand-held skull drill | Shenzhen RWD Life Science Inc. | 78001 | Max: 38,000rpm |
| Modified FPI device | Jiaxing Bocom Biotech Inc. | ||
| Morris water maze | Shenzhen RWD Life Science Inc. | 63031 | Evaluate mouse spatial learning and memory abilities |
| Open field | Shenzhen RWD Life Science Inc. | 63008 | Evaluate mouse locomoation and anxiety |
| Ophthalmic lubricant | Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd. | SC230724B | |
| Sodium diclofenac ointment | Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd. | 221207 | nonsteroidal anti-inflammatory drug |
| Small animal anesthesia system-Enhanced | Shenzhen RWD Life Science Inc. | R530IP | |
| Smart video-tracking system | Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA | V3.0 | Animal tracking and analysis |
| Stereotactic frame | Shenzhen RWD Life Science Inc. | 68043 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M, St Paul, MN, USA | 202402AX | Suture the animal wound |
| Y maze | Shenzhen RWD Life Science Inc. | 63005 | Evaluate mouse spatial working memory |
Referenzen
- Jiang, J. Y., et al. Traumatic brain injury in china. Lancet Neurol. 18 (3), 286-295 (2019).
- Naumenko, Y., Yuryshinetz, I., Zabenko, Y., Pivneva, T. Mild traumatic brain injury as a pathological process. Heliyon. 9 (7), e18342 (2023).
- Zhao, Q., Zhang, J., Li, H., Li, H., Xie, F. Models of traumatic brain injury-highlights and drawbacks. Front Neurol. 14, 1151660 (2023).
- Grant, D. A., et al. Repeat mild traumatic brain injury in adolescent rats increases subsequent β-amyloid pathogenesis. J Neurotrauma. 35 (1), 94-104 (2018).
- Clark, A. L., et al. Repetitive mtbi is associated with age-related reductions in cerebral blood flow but not cortical thickness. J Cereb Blood Flow Metab. 41 (2), 431-444 (2021).
- Mcallister, T., Mccrea, M. Long-term cognitive and neuropsychiatric consequences of repetitive concussion and head-impact exposure. J Athl Train. 52 (3), 309-317 (2017).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14 (2), 128-142 (2013).
- Pham, L., et al. proteomic alterations following repeated mild traumatic brain injury: Novel insights using a clinically relevant rat model. Neurobiol Dis. 148, 105151 (2021).
- Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated mild traumatic brain injury: Potential mechanisms of damage. Cell Transplant. 26 (7), 1131-1155 (2017).
- Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Mol Neurobiol. 56 (8), 5332-5345 (2019).
- Freeman-Jones, E., Miller, W. H., Work, L. M., Fullerton, J. L. Polypathologies and animal models of traumatic brain injury. Brain Sci. 13 (12), 1709 (2023).
- Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: A review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Exp Brain Res. 239 (10), 2939-2950 (2021).
- Ouyang, W., et al. Modified device for fluid percussion injury in rodents. J Neurosci Res. 96 (8), 1412-1429 (2018).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
- Liu, Y., Fan, Z., Wang, J., Dong, X., Ouyang, W. Modified mouse model of repeated mild traumatic brain injury through a thinned-skull window and fluid percussion. J Neurosci Res. 101 (10), 1633-1650 (2023).
- Bolton-Hall, A. N., Hubbard, W. B., Saatman, K. E. Experimental designs for repeated mild traumatic brain injury: Challenges and considerations. J Neurotrauma. 36 (8), 1203-1221 (2019).
- Aleem, M., Goswami, N., Kumar, M., Manda, K. Low-pressure fluid percussion minimally adds to the sham craniectomy-induced neurobehavioral changes: Implication for experimental traumatic brain injury model. Exp Neurol. 329, 113290 (2020).
- Katz, P. S., Molina, P. E. A lateral fluid percussion injury model for studying traumatic brain injury in rats. Methods Mol Biol. 1717, 27-36 (2018).
- Xiong, B., et al. Precise cerebral vascular atlas in stereotaxic coordinates of whole mouse brain. Front Neuroanat. 11, 128 (2017).
- Hoogenboom, W. S., et al. Evolving brain and behaviour changes in rats following repetitive subconcussive head impacts. Brain Commun. 5 (6), 316 (2023).
- Lipton, M. L., et al. Soccer heading is associated with white matter microstructural and cognitive abnormalities. Radiology. 268 (3), 850-857 (2013).
- Rubin, T. G., et al. Mri-defined white matter microstructural alteration associated with soccer heading is more extensive in women than men. Radiology. 289 (2), 478-486 (2018).
- Mcinnes, K., Friesen, C. L., Mackenzie, D. E., Westwood, D. A., Boe, S. G. Mild traumatic brain injury (mtbi) and chronic cognitive impairment: A scoping review. PLoS One. 12 (4), e0174847 (2017).
- Marschner, L., et al. Single mild traumatic brain injury results in transiently impaired spatial long-term memory and altered search strategies. Behav Brain Res. 365, 222-230 (2019).
- Hoogenboom, W. S., Branch, C. A., Lipton, M. L. Animal models of closed-skull, repetitive mild traumatic brain injury. Pharmacol Ther. 198, 109-122 (2019).
- Cunningham, J., Broglio, S. P., O’grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: A systematic review. J Athl Train. 55 (2), 132-158 (2020).
- Fidan, E., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in the developing brain: Effects on long-term functional outcome and neuropathology. J Neurotrauma. 33 (7), 641-651 (2016).
- Nguyen, T., et al. Repeated closed-head mild traumatic brain injury-induced inflammation is associated with nociceptive sensitization. J Neuroinflammation. 20 (1), 196 (2023).
- Ren, H., et al. Enriched endogenous omega-3 fatty acids in mice ameliorate parenchymal cell death after traumatic brain injury. Mol Neurobiol. 54 (5), 3317-3326 (2017).
- Lillie, E. M., Urban, J. E., Lynch, S. K., Weaver, A. A., Stitzel, J. D. Evaluation of skull cortical thickness changes with age and sex from computed tomography scans. J Bone Miner Res. 31 (2), 299-307 (2016).
