細菌クリアランスの測定による 線虫 の食物摂取量の定量化

図1:バクテリアクリアランスアッセイの概略図。プロトコルの主要セクションのグラフ概要(上から下へ):細菌の調製、線虫集団の同期、96ウェルプレートへの播種、線虫の滅菌、薬剤の追加、1日目と4日目のOD600の測定。これらの具体的な手順の詳細な説明は、各図の左側に示されています。略語:OD =光学密度;FUdR = フルオロデオキシウリジン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 1.バクテリアの準備 注:このセクションでは、このアッセイで使用される摂食細菌の調製について詳しく説明します。アッセイで使用される特定の 大腸菌 株はOP50と呼ばれます。OP50は、 C.エレガンスの餌として最も広く使用されている株です。使用されるOP50株はカルベニシリン/アンピシリン耐性であり、これにより、ワーム培養物と他の細菌との交差汚染を防ぎます9。 OP50は4〜5日前に準備し、使用前日にX線を照射してください。OP50に遭遇するすべての材料が無菌であることを確認してください29,30。 -8日目:水曜日(第1週):5 mLのLBに100 μg/mLのアンピシリンと0.1 μg/mLのアムホテリシンB、および単一のOP50コロニーを接種して、プレイノキュラムを調製し、バクテリアシェーカーで37°Cで約6時間インキュベートします。培養物が濁るのに十分な成長を遂げるために、早めに接種してください。 培養物が曇ったら、100 μg/mL のアンピシリンを含む 250 mL の TB で OP50 の preinoculum 培養物を 1:2,000 に希釈します。培養物をバクテリアシェーカーで一晩、37°Cで17〜19時間インキュベートします。注:培養物が19時間を超えて成長することは許されません。 -7日目:木曜日(第1週)17-19時間のインキュベーション後、OP50液体培養物を滅菌遠心チューブに移し、4°Cの卓上遠心分離機で3,100 × g で15分間遠心分離します。 上清を捨て、OP50ペレットを滅菌水で再懸濁し、再遠心分離します。このウォッシュを2回繰り返します。 2回目の洗浄後、上清を捨て、OP50ペレットを滅菌水に再懸濁して50mLの容量にし、事前に秤量した50mLコニカルチューブに移します。OP50を4°Cの卓上遠心分離機で3,100 × g で20分間遠心分離してペレット化します。 3回目の洗浄後、チューブに水が残らないように、残っているすべての上清を慎重に取り除きます。ペレットの入った遠心分離管の重量から空の遠心分離管の重量を差し引いて、ペレットの重量を計算します。注:ペレットの重量は通常3〜3.5gの範囲です。 OP50ペレットをS-completeバッファーに100 mg/mLの濃度まで完全に再懸濁し、凝集物が存在しないことを確認します。 100 mg / mLでのOP50の濃度が2 × 1010 bacteria / mLに対応していることを確認してください。.光学密度と mL あたりの細菌数との関係がわかっている場合は、分光光度法で mL あたりの細菌濃度を決定します。必要に応じて、S-コンプリートバッファーを使用して、OP50供給溶液の濃度を2 × 1010 bacteria/mLに調整します。 寒天プレートでOP50をテストして、汚染されているかどうかを判断します。 OP50をS-completeバッファーに懸濁して4°Cで保存します。 -3日目: 月曜日(第2週)X線照射で細菌を死滅させ、アッセイ中の細菌の増殖を防ぎます。 2.同期ワーム培養の準備 注: このセクションでは、同期ワーム集団の準備について説明します。ワームの個体群と接触するすべての材料は無菌です。すべてのプレートは、特に断りのない限り20°Cに保たれます。 -6日目:金曜日(第1週)、午後4:00動物を新しい皿に移します。例えば、NGMプレートでは、ほとんどの寄生虫が飢餓状態のL1幼虫で構成されています。注: 母集団が混在している場合でも結果が生成されます。長期間飢餓状態にあるL1線虫を使用すると、飢餓が少なくとも3世代にわたってエピジェネティックなマークを残す可能性があるため、現在または将来の世代の摂食行動に影響を与える可能性があります。 ワームは1mL以下の滅菌水で洗い流してください。洗い流された線虫集団の~300 μLを、濃縮OP50(~300 mg/mL)を播種したNGMプレートに分注します。プレートをプレートドライヤーまたはブンゼンバーナーで乾かします。プレートを20°Cでインキュベートし、母集団の多くが妊娠した成虫を含むまで(月曜日)。注:この時間枠は、野生型のN2線虫の集団に最適化されており、株ごとに異なる場合があります。発生が遅れている線虫は、試験されたすべての株が同時に成虫になるまで、早期にチャンクおよび/または播種することを考慮に入れる必要があります。 -3日目:月曜日(第2週)午前10:00同期母集団の確立注意！漂白剤は皮膚や目に腐食性があります。取り扱いには手袋と安全メガネが必要です。ワームは、最大10mLの滅菌水でプレートから洗い流して収集します。このワーム/水溶液を15mLのコニカルチューブに移します。 ベンチトップの重力シンクで約4分間ワームを洗浄します(逆に、310 × gの卓上遠心分離機で2分間遠心分離して洗浄します。 小さな先端を使用して吸引して上清を捨て、滅菌水を最大15mL追加します。.3回繰り返します。 上清を取り除き、新たに調製した漂白剤/ NaOH溶液5 mL(家庭用漂白剤1.8 mL、10 N NaOH0.5 mL、dH2O7.7 mL)を加えます。. 室温で5分間、または線虫が開くまでインキュベートします。少なくとも10秒間、毎分穏やかに渦を巻きます。解剖顕微鏡で進行状況を監視します。注:ワームをこじ開けるのに必要な時間は、ひずみごとに異なる場合があります。ワームを漂白剤溶液に長時間放置すると、生存不能な卵子が発生する可能性があります。 M9バッファーを添加して、すべての成虫が割れるか溶解したら反応を中和し(最終容量は15 mL)、1,300 × gで2分間遠心分離します。 卵を13mLのM9バッファーで3回洗浄します。 卵子を10 mLのS-complete bufferで1,300 × gで2分間遠心分離し、1回洗浄します。 上清を吸引し、10 mLのS-completeを加え、懸 ?? 液を新しい15 mLコニカルチューブに移します。.チューブを室温で一晩中ゆっくりと回転させます。 オプション:S-コンプリートバッファーでの最終遠心分離後に成体死体が存在する場合は、40 μmのセルストレーナーでワーム溶液をろ過します。 -2日目:火曜日(第2週)、13:00動物を皿に播種する解剖スコープを使用して、ワームが孵化したかどうかを確認します。S-コンプリートバッファー中の線虫の濃度を測定するには、解剖スコープを使用して10 μL滴中の線虫の個体数をカウントします。各サンプルについて5〜10滴を数えます。各10 μL滴中の線虫の濃度が1滴あたり30線虫を超える場合は、計数を容易にするために、全ストックをS-completeで1滴あたりの線虫密度を低く希釈してください。 液体ワーム混合物を96ウェルプレートの各ウェルに120 μLの容量で次のように播種します(最終濃度):S-コンプリートに60匹のワーム/mL、50 μg/mLのカルベニシリン、0.1 μg/mLのアムホテリシン、およびセクション1で調製したOP50の6 mg/mL。注:調製する総量は、プレートの数によって異なります(96ウェルプレートあたり~12mL)。各ウェルには6〜12匹のワームがいるはずです。あるいは、Union BiometricaのCOPAS FPなどの大きな粒子フローサイトメトリーを使用して、10匹の線虫を各ウェルに正確に選別することもできます(クラウディング効果のセクションを参照)。 また、セクション1で調製した50 μg/mLのカルベニシリン、0.1 μg/mLのアムホテリシン、および6 mg/mLのOP50のワー ムを含まない 液体混合物も含みます。 120 μLの線虫混合物を96ウェルプレートのH列に入れ、前述のように自己溶解値を決定するために使用されます。列A〜Gのワームとの混合物のウェルあたり120μLを入れます。注:ピペッティング中は、ワームが懸濁状態にあることを確認してください( 図2A、Bを参照)。底が平坦な透明な96ウェルプレートを使用しています。私たちのプレートレイアウトは、プレートを分割して4つまたは6つの条件を生成し、列の各ペアが異なる薬物処理または線虫株になり、下の行が「線虫なし」コントロールとして機能します(図2A、B)。 汚染や蒸発を防ぐために、プレートをテープシーラーで密封します。動物がL4線虫になるまで、プレートを20°Cで約65時間インキュベートします。 0日目:木曜日(第2週)の正午前。フルオロデオキシウリジン(FUdR)の添加によるワーム集団の滅菌。0.6 mM FUdRストック溶液30 μLを添加して、各ウェル内の動物を滅菌します。テープシーラーを使用してプレートを再シールし、マイクロタイタープレートシェーカーでプレートを800rpmで20分間振とうします。プレートを20°Cインキュベーターに戻します。注:このステップでは、最終OP50濃度を6 mg/mLから5 mg/mL(1 × 109 bacteria/mL)に減らし、各ウェルの最終容量は150 μLです。動物が成体になる前に、FUdRをL4ステージに追加することが重要です。 1日目:金曜日(第2週)文化に薬物を追加します。午前9:00までに、ほとんどの動物が妊娠しており、各井戸にいくつかの卵が含まれていることを確認します。必要に応じて、任意の薬物を希望の濃度まで追加します(ディスカッションを参照)。 薬剤を添加した後、テープシーラーでプレートを密封し、プレートシェーカーでプレートを800rpmで20分間振とうします。注:振とうすると、シーラーに触れることなく、すべての細菌の塊が溶解します。シーラー上の細菌の塊または液体の両方がOD600 の読み取り値を歪めます。シーラーに液滴が付着している場合は、310 × gで10〜20秒間短時間回転させます。シェーカーでもう一度5分間振って測定します。 マイクロタイタープレートシェーカーで20分間振とうした後、蓋とシールを取り外し、プレートリーダーでOD600を測定します。これは1日目のOD600の測定です。プレートを密封し、20°Cのインキュベーターに戻します。注:バクテリアはすぐに落ち着くため、プレートを振ってから10分以内に読み取りが行われます。 倒立顕微鏡を使用して、薬剤が追加されている場合は、ワームの集団に汚染や毒性の兆候がないか確認します。プレートを20°Cインキュベーターに戻します。 4日目:月曜日(第3週)4日目のOD600 を読んでみてください。1日目(ステップ2.5.1.3)から読み取り手順を繰り返して、 4日目 のOD600値を取得します。 OD600 を測定する前に、マイクロタイタープレートシェーカーでプレートを800rpmで20分間振とうします。 倒立顕微鏡では、理想的には2倍の対物レンズを使用して、各ウェル内の線虫の個体数をカウントし、スプレッドシートに記録します。カウント後、プレートを20°Cインキュベーターに戻します。注:補足資料に記載されているスコアリングシートのサンプルをご覧ください。 4日目の読書の後、食物摂取量の測定は完了です。必要に応じて、寿命分析のためにこれらのプレートを保管してください。注:このプロトコルは、SolisおよびPetrascheck31と互換性があります。 3. 食物摂取データの分析 図2:設計と解析 (A, B) 列Hに「ウォームなし」の制御井がある4および6条件での可能なプレート設計。これらの井戸は、自己溶解率を決定するために必要です。各プレートには、常にN2未処理のコントロール集団を参照として含めてください。(C)提供されたスプレッドシートに収集されたサンプルデータで、線虫の数(緑のボックス)、1日目と4日目の2つのOD600測定(オレンジのボックス)、自己分解値(青のボックス)、および式(2)((OD600 -selflysis)を使用した評価)赤のボックス。ここで示す具体例では、(B)に示すプレートデザインを使用しています。略語:OD =光学密度;X0 = 井戸あたりのワームの数。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 注:このセクションでは、このプロトコルのセクション2からの食物摂取データがどのように分析されるかについて説明します。最初に計算される値は、 自己溶解 制御値です。細菌は、虫がいなくても、液体中で時間の経過とともに溶解します。この 自己分解 値は、多くの化学物質の影響を受ける可能性があり、ワームの食物摂取量と比較して比較的大きいため、制御する必要があります。ステップ2.3.1.4で説明し、 図2A、B のプレートレイアウトに示されているように、行Hには、ワームを除いて同じ溶液が含まれています。 図2Bに示すプレートセットアップでは、条件ごとに14のウェルがあり、それぞれ2つの 自己分解制御ウェル(行H、「ワームなし」)があります。 式(1)を使用して、各条件でワームなしの制御井戸の自己溶解制御値を計算します。ウェルのレプリケートグループごとに、ステップ 2.3.1.4 で説明したように、少なくとも 2 つのワームなし制御ウェルがあることを確認します。すべての no-worms 制御井戸の平均を、レプリケート グループの自己溶解値に使用します。Selfysis = mean(OD600 Day 1 – OD600 Day 4) (1)注:図2Bに示すプレートセットアップでは、行Hの2つの自己分解制御ウェルの平均を計算することにより、6つのグループごとに1つずつ、6つの自己分解値を計算します。 方程式を使用してワームあたりの食物摂取量を計算します     (2).注:スプレッドシート(赤いボックス、 図2C)で使用されている式で、X0はウェルあたりのワームの数です。 各ウェルのワームあたりの食物摂取量を決定した後、条件全体の平均と標準偏差を計算します。注: 図2Bに示すプレートセットアップでは、統計的な比較には、条件ごとに14のレプリケートウェルで十分です。 各条件を、それぞれの N2 未処理のコントロール集団に正規化します。送りの変化を折り畳み変化またはN2送りの割合で示します。注:正規化が行われるのは、式(2)のOD600/X0の絶対値が、異なる日に実施された実験間で異なる可能性があるためです。