ジャガイモの単一および複合ストレスに対する形態学的および生理学的応答を決定するためのハイスループット画像ベース表現型

1.植物材料の準備と成長条件 in vitro ジャガイモ(Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta)の切片を組織培養から250mLのポットに移植します。 ポットに完全に飽和したクラスマン基質2を入れ、低照度条件下で成長チャンバーに1週間保管します。 照度計を使用して、25%の白色光と35%の赤外線の組み合わせで、キャノピーレベルの光条件を160μmol・m-2・s-1 に調整します。 in vitro挿し木を土壌中で育ててから10日後に、3つのLポット(直径15.5cm、高さ20.5cm)に植物を移植します。 3Lのポットに1850gの3:1 Klasmann Substrate 2:Sandを入れます。 植物を320μmol・m-2・s-1 の光条件下で、55%の白色光と81%の赤外線の組み合わせで成長チャンバーに入れ、長日体制(16時間の光周期)に設定します。 成長チャンバー内の温度を昼/夜は22°C/19°Cに設定し、実験全体で相対湿度(RH)を55%に設定します。 鉢の重量を60%の土壌相対含水率(SRWC)に維持し、成長と収量30,31を維持するための適切な制御レベルとして。注:以前の試験に基づくと、体積含水量を60%以上に維持すると、土壌表面のコケの成長が促進され、植物病害のリスクが高まりました。さらに、コケの存在は、クロロフィル蛍光イメージングから誤解を招くような正のシグナルを生成する可能性があり、これをフィルタリングするのが困難です。次の式を使用します:SRWC%=(FW-DW)/(TW-DW)× 100、ここでFWは土壌の新鮮な重量、TWは膨らんだ重量、DWは乾燥重量32です。3つの異なるKlasmman Substrate 2混合バッグから土壌サンプル(100 g)を複製として選択し、土壌の新鮮な重量を秤量します。 鉢が滴り落ちることなく水を保持するまで土壌を水で飽和させ、土壌の膨らみの重量を量ります。 土壌サンプルが完全に乾くまで、サンプルを80°Cのオーブンに3日間置き、土壌乾燥重量33を秤量します。 蒸発を減らすために、ポットの表面に青いマットを置きます。注:画像セグメンテーションで植物のピクセルから土壌の背景を差し引くには、青色が必要です。 治療ごとに10回の生物学的複製を選択します。 灌漑中にポットをランダム化します(合計50ポット)。 植物を支え、表現型システムに配置する際の機械的損傷を避けるために、青いホルダーを追加します。 2.ストレスの適用 結節化の初期段階( in vitro 挿し木を移植してから28日後)で、植物を5つの処理グループに分け、処理ごとに10の植物を表現型付けします(図1)。 次のように、単一応力と複合応力を有害でないレベルまで誘導します。成長チャンバーでは、植物を制御し、干ばつ、浸水処理を昼夜を問わず22°C/19°Cで維持します(ステップ1.7)、SRWCの割合を変えます。実験全体で60%SRWCで制御(C)。干ばつ(D)は20%SRWCで7日間徐々に発生し、その後1日間回復します。160%SRWCによる浸水(W)を5日間行い、その後10日間の回復。 浸水処理で土壌表面より上の水位を維持するために、空のポットにビニール袋を挿入し、準備した2番目のポットに土を入れたメインポットを置きます。 植物を30/28°Cの昼夜および55%RHの成長カプセルに入れて熱処理します。次のように、単一および複合熱応力を課します。熱(H)の場合、SRWCの60%で温度を30〜28°Cに15日間維持します。 熱+干ばつ+浸水(HDW)のトリプルストレスの場合、最初の7日間は30°C/28°Cの昼/夜の温度で植物を熱処理にさらし(60%SRWCを維持)、残りの7日間は干ばつ+熱複合処理(20%SRWCと30°C/28°C)を行い、最後に植物を1日間浸水ストレスにさらします。後者の場合は、植物を成長チャンバーに戻し(条件についてはステップ1.7を参照)、160%SRWCに1日間浸水を誘発します。注:誘発されたストレスの選択された持続時間は、処理された植物の100%の生存率で有害な影響なしにストレス効果を示したパイロット実験に基づいていました。成長チャンバー環境では、環境条件の変動は温度が0.2°C±、湿度が±3%の範囲でした。 3. 表現型解析のための植物調製 成長チャンバー内の午前6:00にライトが点灯した後、表現型プロトコルの開始前に少なくとも2〜3時間、一定の成長光条件(320μmol・m-2・s-1)の下で植物が順応するのを待ちます。これにより、光合成と気孔調節が定常状態にあることが保証されます34。 測定の前に、自動採点がスタンバイモードにあり、温室内に配置されている間に、植物を栽培場所からシステムへの手動ロードに使用される表現型システムの成長バッファー領域に移します(補足図1、補足図2、および 補足図3)。注:植物は、3.5時間続く表現型期間中、成長緩衝領域に保持されました。温室内では、環境条件の変動は、温度が±2°C、湿度が±5%、光強度が20%の変動でした。したがって、測定はすぐに開始し、植物に対する温室条件の影響を避けて短くする必要があると考えてください。 表現型解析プラットフォームでは、セクション4で指定されている測定プロトコルに従って、所定の間隔でコンベアベルト上をイメージングセンサーに自動的に移動するディスクにポットを配置します。 各プラント/トレイに一意のIDをラベル付けして、実験全体を通じて測定データが正しいプラントに割り当てられるようにします。 4. 表現型プロトコール 複数のイメージングセンサー(クロロフィル蛍光、熱IR、RGB、ハイパースペクトルイメージング)を使用して表現型プロトコールを最適化し、植物の生理学的パラメータと形態学的パラメータの両方を同時に測定できるようにします(図2)。注:植物の反応は環境条件と日周の影響を反映しているため、鉢のランダム化と1日の同じ期間内に表現型を実行することを考慮することが重要です。 表現型解析プラットフォームでは、植物が適応トンネル(図2A)を通ってシステムに入ることを確認し、そこで最初に植物の高さが取得され、次に各センサーの高さが固定作動距離に基づいて調整されます。 ソフトウェアを使用して、測定プロトコルで正当化されているように、2ラウンドで測定を行います。最初のラウンドでは、クロロフィル蛍光と熱イメージングを使用して「高速反応」として定量化された生理学的応答の測定が含まれます。 まず、熱ストレス治療下の生理学的パラメータを測定し、次に残りの治療を行います。 第2ラウンドでは、構造RGBやハイパースペクトルイメージングなど、より遅い応答を評価するための他の測定を進め、その後、重量評価と散水を行います。 計量と散水のステップでは、各プラントの基準重量を定義して、特定の処理に対する自動散水と計量を可能にします。総基準重量には、ディスクの重量、コンベヤーベルトにあるインサート、定義されたプロトコルの支持ブルーホルダー、ブルーマット、ポット、土壌、および植物バイオマスが含まれていることを確認します。 計量および散水ステップ中の蒸発散量を正確に測定するには、参照として空のポットを準備します。さらに、植物バイオマスの重量を補正するために、追加のポットを準備します。 50本の植物を測定するには、表現型プロトコル全体の持続時間は215分(第 1ラウンドで85分、第 2ラウンドで130分)かかります。 表現型は、制御条件下ですべての植物を毎日(治療の1日前)に行い、その後、ストレス治療を誘発して動的応答を監視し、誘発されたストレスの初期段階と後期を評価します。 5. 撮像センサーごとの設定調整 キネティッククロロフィル蛍光イメージング注:速度論的クロロフィル蛍光は、非生物的ストレスを含むさまざまな環境条件に応じた植物の光合成能力を調査し、光化学と熱放散(非光化学プロセス)の量子効率に関する貴重な情報を提供するために使用されます。光適応型植物のクロロフィル蛍光測定を短時間光プロトコールを用いて行い、異なる処理下での植物の応答を判別します。 500μmol・m-2・s-1のクールホワイトLED(6500K)を装備した適応トンネル内の光の下で、35植物を5分間順応させます。注:クロロフィル蛍光イメージングは、植物の光合成能力の変化を監視するために使用される光適応後の最初の測定です。 プラントのサイズと必要な光強度に応じて、事前定義されたプロトコルを選択し、最適化します。 カメラや光の強度設定など、測定設定を最適化して、最適な信号対雑音比で強い信号を確実に取得できるようにします。シャッター(露光時間、フラッシュの測定時間)や感度(カメラの電気的ゲイン)などのカメラ設定を調整します。シャッターは2ms、感度は12%で使用します。注意: これらの値は、葉のサイズと形状、およびキャノピーの上部とイメージングセンサーの間の定義された距離に基づいて調整されます。 光線強度を500μmol・m-2・s-1 に調整し、飽和パルスを3200μmol・m-2・s-1に設定します。これは、光線の少なくとも6〜7倍です。 光順応トンネルでの測定前に、光順応プラントの5分間の光順応プラントでパラメータを測定するには、Lss(後述)。 光適応植物の定常光系II(PSII)量子収率を推定するには、短光プロトコル(図3)を選択し、プロトコルを次のように設定します。注:プロトコルの持続時間は、プラントあたり10秒でした。測定を開始するには、500 μmol・m-2・s-1 の冷白色光線を3秒間オンにして、光の定常蛍光(Ft_Lss別名を測定します。Ft’) 3200 μmol・m-2・s-1 の飽和パルスを 800 ms 印加して、光 (Fm_Lss 別名 ?) の定常状態の最大蛍光を測定します。Fm’) アクチンライトをオフにしてから、遠赤色ライト(735 nm)をオンにして、PSIIが暗闇で800ミリ秒リラックスし、光の定常状態の最小蛍光(FO_Lss別名を測定できるようにします。Fo’)です。 相対パラメータを計算するには、背景を差し引いて関連するパラメータを抽出するデータアナライザソフトウェアを使用します。注:使用されるプロトコルから抽出されたパラメータは、Fv / Fm_Lss別名として決定される光定常状態での光適応サンプルのPSII光化学の最大効率です。Fv’/Fm’、光定常状態における光化学系IIの量子収率または動作効率は、QY_Lss別名として定義されます。φPSII = Fq’/Fm’ であり、PSII (酸化 QA) の開放反応中心の割合は qL_Lss = (Fq’/Fv’) x (F0’/Ft’) として求められます。 熱赤外線(IR)イメージング注:サーマルIRイメージングは、実際のキャノピー温度の非侵襲的測定に使用され、それによって異なる気孔の調節を決定します。サーマルIRイメージングユニットでは、サーマルカメラをロボットアームに横方向に搭載し、側面からキャノピーの温度を測定します。画像処理中に、画像化されたオブジェクトの温度に対する背景温度のコントラストを上げるには、サーマルカメラの反対側にある自動的に制御された加熱された壁を使用してコントラストを上げます。イメージングユニット内の空気温度より8°C高い壁の温度を調整します。注:熱画像は、ラインスキャンモード35を使用して暗闇で取得されました。 画像取得後、RGBサイドビューデータに基づいて植物マスクを生成し、それを使用して画像解析で熱データと共レジストレーションします。これにより、スキャンされたオブジェクトを正確に識別しながら、プラントホルダーなどのバックグラウンド干渉を排除します。 実験全体を通じて変動する環境条件の影響を防ぐために、パラメータの温度差(デルタTまたはΔT)を計算します。注:デルタT(ΔT)は、葉の表面の測定温度(植物の検出された表面全体からのすべてのピクセルの平均)とイメージングボックス内の周囲温度との差として定義されます。 RGBイメージング注:RGBイメージングは、400〜700 nmの可視範囲の光を検出する視覚慣性システム(VIS)カメラに基づいており、植物の形態、構造、およびカラーインデックスの特徴の抽出の詳細な分析に使用されます。イメージングユニットには、トレイを正確に位置決めするための回転テーブルが含まれており、同時に側面図のマルチアングルイメージングが可能です。 ラインスキャンモード(RGB1)とスナップショットモード(RGB2)のトップビューイメージングで、3つの角度(0°、120°、240°)から植物を撮影するサイドビューイメージングに基づいてRGBイメージングを設定します。 どちらのカメラにもLEDベースの光源が搭載されており、画像化された植物の均一な照明を確保し、形態学的および色の特徴を正確に決定します。 データアナライザソフトウェアを使用して計算されたパラメータを抽出します。 側面図と上面図に基づく追加のパラメータについては、植物の体積(デジタルバイオマス)36を計算します。 相対成長率(RGR)37を計算します。ここで、Tn と Tn+1 は時間間隔 (日) を示します。 ハイパースペクトルイメージング注:ハイパースペクトルイメージングは、植物の分光反射率の視覚化に使用されます。葉の反射率の変化は、特定の植物のさまざまな生理学的状態の指標です。ハイパースペクトルイメージングセンサーを使用して、380〜900 nmの範囲の可視近赤外線(VNIR)ハイパースペクトルカメラと900〜1700 nmの範囲の短波長赤外線カメラ(SWIR)を使用して、光スペクトルの可視部分のキャノピー反射率を定量化します。 カメラは、ハロゲン管光源(600 W)が実装されたロボットアームに取り付けられており、XZエリアを横切って移動する画像取得中に均一でスペクトル的に適切なサンプル照明を実現します。 どちらのカメラもラインスキャンモードで動作し、遮光されたイメージングボックスに配置されます。 各測定ラウンドの前に、暗電流キャリブレーションとスペクトル反射率テフロン標準を使用した放射量キャリブレーションの2つのキャリブレーション測定(自動)を実行します。 ダーク キャリブレーション イメージは、未処理のキャリブレーション イメージとホワイト キャリブレーション イメージから差し引かれ、ダーク電流ノイズが除去されます。次に、減算後の生の画像をホワイト キャリブレーション イメージで除算することにより、最終的なハイパースペクトルを生成します。 6. データのエクスポートと画像解析 データアナライザソフトウェアを使用して、画像処理パイプラインの自動抽出、バックグラウンド減算、 およびプラントマスクセグメンテーション を行います(図2B)。 このソフトウェアは、マスクの適用、植物がそれらの背景から分離されるバックグラウンド減算、およびパラメータ計算がRGBイメージング38 およびサーマルイメージング20について説明したように処理される完全自動解析を実行する。 RGB 画像で生成された Plant Mask と Tray Mask で定義された植物固有のピクセルから、測定および計算されたパラメーターを抽出します。 画像が完全に選択されなかった場合(後の開発段階での植生の緑化の変化やストレス治療の影響により発生する可能性がある)、ソフトウェアでローカルデータ分析部分を開き、各センサーに応じてデータアナライザーソフトウェアで 植物マスク 設定を再調整します。 クロロフィル蛍光画像処理では、クロロフィル蛍光 植物マスク 設定の分析パラメーターを調整します(補足図4)。しきい値を True に設定すると、プラントのセグメンテーションが自動的に実行されます。 Mask Frame IndexをFalseに設定すると、Plant Mask検出では、クロロフィル蛍光プロトコルで定義されているTime-Visualフレームが使用されます。 熱画像処理で、 プラントマスク 解析のパラメータを設定します(補足図5)。オブジェクト マスク生成の自動しきい値を False に設定します。 RGBサイドイメージからのマスクをTrueに設定して、解析に使用します。 RGB画像処理では、 植物マスク の設定解析パラメータ(補足図6 、 補足図7)を樹種や発生段階に応じて調整します。オブジェクトマスク生成の定義であり、使用される色成分(赤、緑、青の成分)を定義する式 4*G-3*B-Rを選択します。注意: この標準式およびその他の設定は、使用するカメラの種類(トップまたはサイズ view)、適用された処理、およびさまざまな栽培品種によって異なります。 拡張されたグリーンチャンネルのグレースケール画像をバイナリ画像に変換するために使用する しきい値 を調整し、植物が覆う表面を決定します。 ノイズと無効なピクセルを減らし、不足しているピクセルを埋めるために使用される 中央値フィルターサイズ を調整します。 分析に含める オブジェクトの [最小サイズ ] をピクセル単位で調整します。 マスク オブジェクトの 穴の最小サイズ をピクセル単位 (通常は数十ピクセル) で調整します。この値より小さい穴は閉じられ、オブジェクトのピクセルに取り込まれます。 [ 反射削減を使用] を True に設定して、各ピクセルの RGB 値を正規化します。 Skip Bad Exposed Points を True に設定して、植物マスクから露出オーバー/アンダー露出ピクセルをトリミングします (例: 表面反射の省略や、ノイズが信号よりも大きい暗いピクセル)。 データアナライザソフトウェアを使用してRGBから分析されたセグメンテーション設定に色を付け、ストレス応答と植物の老化に関連する色の変化に関する情報を提供します。注:緑度は、植物の発達のすべての段階を表す事前定義された色の範囲を使用して推定されます。植物の表面に対応するすべてのピクセルからのカラーチャネルの強度は、カラーセグメンテーションのソースカラーマップとして使用するためにグループ化およびクラスター化されました。処理されたRGB画像(削除された背景)、カラーマップ(特定の分析のための色相のリスト)をソフトウェアの入力として提供します。 偏りのない結果を得るには、「トレーニング」データセットを使用して色相選択を実行し、さまざまな発達段階と治療法を選択します。注:分析は、このトレーニングデータセットから各画像の各ピクセルのR、G、およびBの値を保存します。 ソフトウェアを使用して、色定義出力の色相数(6色相を選択)を、各チャネルで0〜255の範囲で定義します。 データアナライザソフトウェア(Colors)で生成された色相のリストを提供します。 ハイパースペクトル画像処理では、ハイパースペクトル アナライザー ソフトウェアに実装されたピクセル単位解析を使用して、取得したハイパースペクトル データを処理します。これには、放射分析とダーク ノイズのキャリブレーション、バックグラウンド減算、プラント マスク セグメンテーションが含まれます。平均スペクトルと植生指数を使用して、さらに解析します。 VNIR ハイパースペクトル カメラで撮影した VNIR イメージからハイパースペクトル イメージからデータを抽出するためのマスクを作成します。SWIR ハイパースペクトル スキャンでは、SWIR 解析に基づいてプラント マスクを生成します。VNIRプラントマスクでは、式1.2 *(2.5 *(R740-R672)-1.3 *(R740-R556))を使用して、Rが特定の波長での反射率値を表す画像を視覚化します(補足図8)。 SWIRプラントマスクでは、画像処理で(R960-R1450)-(R960-R1200)の式を使用して画像を視覚化します(補足図9)。 7.計量と散水 計量および散水手順中に(散水前)重量を保管してください。次に、散水を適用し、散水後も重量を保ちます。 参照モードでトレイに水をやる – 各トレイにはデータベースに保存されている参照値があり、常にそれに水をやっていました。処理に基づいて参照を決定します。 8. データ分析 ANOVAとShapiro検定を使用してデータを分析します。 R studio(バージョン4.2.3)のPairwise Wilcoxテストで、(dplyr)、(tidyverse)、(rstatix)、および(ggpubr)パッケージを使用して、異なる処理間のペアワイズ比較を行います。注:画像解析は、データアナライザソフトウェアを使用して自動的に行われました。画像取得をさらに分析するには、センサー専用のデータアナライザーソフトウェアを使用します。