Summary

Nachweis und Quantifizierung von Mono-Rhamnolipiden und Di-Rhamnolipiden, die von Pseudomonas aeruginosa produziert werden

Published: March 29, 2024
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Summary

Pseudomonas aeruginosa produziert die Rhamnolipid-Biotenside. Die Dünnschichtchromatographie detektiert und bestimmt den Anteil der Mono- und Dirhamnolipide, die von jedem Stamm produziert werden. Die Quantifizierung der Gesamtrhamnolipide umfasst die Bewertung der Rhamnose-Äquivalente, die in diesen Biotensiden vorhanden sind, die mit Hilfe der Orcinol-Methode aus den Kulturüberständen extrahiert werden.

Abstract

Das Umweltbakterium Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer Erreger mit hoher Antibiotikaresistenz, der eine Gefahr für die Gesundheit darstellt. Dieses Bakterium produziert einen hohen Gehalt an Biotensiden, die als Rhamnolipide (RL) bekannt sind, bei denen es sich um Moleküle mit erheblichem biotechnologischem Wert handelt, die aber auch mit Virulenzmerkmalen in Verbindung gebracht werden. In dieser Hinsicht kann der Nachweis und die Quantifizierung von RL sowohl für biotechnologische Anwendungen als auch für biomedizinische Forschungsprojekte nützlich sein. In diesem Artikel demonstrieren wir Schritt für Schritt die Technik zum Nachweis der Produktion der beiden von P. aeruginosa produzierten RL-Formen mittels Dünnschichtchromatographie (DC): Mono-Rhamnolipide (mRL), Moleküle, die aus einem Dimer von Fettsäuren (hauptsächlich C10-C10) bestehen, das an eine Rhamnose-Einheit gebunden ist, und Di-Rhamnolipide (dRL), Moleküle, die aus einem ähnlichen Fettsäure-Dimer bestehen, das an zwei Rhamnose-Einheiten gebunden ist. Darüber hinaus stellen wir eine Methode zur Messung der Gesamtmenge an RL vor, die auf der sauren Hydrolyse dieser Biotenside basiert, die aus einem Überstand der P . aeruginosa-Kultur extrahiert wurden, und dem anschließenden Nachweis der Konzentration von Rhamnose, die mit Orcin reagiert. Die Kombination beider Techniken kann verwendet werden, um die ungefähre Konzentration von mRL und dRL abzuschätzen, die von einem bestimmten Stamm produziert wird, wie hier am Beispiel der Typstämme PAO1 (Phylogruppe 1), PA14 (Phylogruppe 2) und PA7 (Phylogruppe 3).

Introduction

Pseudomonas aeruginosa ist ein Umweltbakterium und ein opportunistischer Krankheitserreger, der aufgrund seiner Produktion von Virulenz-assoziierten Merkmalen und seiner hohen Antibiotikaresistenz sehr besorgniserregendist 1,2. Ein charakteristischer Sekundärmetabolit, der von diesem Bakterium produziert wird, ist das Biotensid RL, das in koordinierter Weise mit mehreren Virulenz-assoziierten Merkmalen wie dem Phenazin Pyocyanin, einem Antibiotikum mit Redoxaktivität, und der Protease Elastase3 hergestellt wird. Die tensioaktiven und emulgierenden Eigenschaften von RL wurden in verschiedenen industriellen Anwendungen genutzt und werden derzeit kommerzialisiert4.

Die meisten P. aeruginosa-Stämme, die zu den Phylogruppen 1 und 2 gehören, produzieren zwei Arten von RL: mRL, das aus einer Rhamnose-Einheit besteht, die mit einem Fettsäuredimer verbunden ist, das hauptsächlich aus 10 Kohlenstoffatomen besteht, und dRL, das eine zusätzliche Rhamnose-Einheit enthält, die mit der ersten Rhamnose4 verbunden ist (siehe Abbildung 1). Es wurde jedoch berichtet, dass zwei kleinere P. aeruginosa-Phylogruppen (Gruppen 3 und 5) nur mRL 5,6 produzieren. Die beiden Arten von RL enthalten ein Gemisch von Fettsäuredimeren, die, wie erwähnt, hauptsächlich C10-C10 sind, aber es werden auch kleinere Anteile von Molekülen hergestellt, die C12-C10-, C12-C12- und C10-C12:1-Dimere enthalten. Die Charakterisierung der RL-Kongenere, die von verschiedenen Stämmen unter Verwendung von HPLC MS/MS produziert werden, wurde berichtet 7,8. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden können nur zwischen mRL und dRL unterscheiden, können aber nicht für die Charakterisierung der RL-Kongenere verwendet werden.

P. aeruginosa und einige Burkholderia-Arten sind natürliche Produzenten von RL9, aber das erstgenannte Bakterium ist der effizienteste Produzent. Kommerziell genutztes RL wird jedoch derzeit in Pseudomonas putida KT2440-Derivaten hergestellt, die P. aeruginosa-Gene exprimieren, um die Verwendung dieses opportunistischen Erregers zu vermeiden10,11. Der Nachweis und die Quantifizierung von RL, die von P. aeruginosa produziert werden, sind von großer Bedeutung für die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die an der Ausprägung von Virulenzmerkmalen beteiligt sind12, für die Charakterisierung von Stämmen, die zu den Kladen 3 oder 513 gehören, und für die Konstruktion von P. aeruginosa-Derivaten, die diese Biotenside überproduzieren und gleichzeitig eine verminderte Virulenz aufweisen14. Die Produktion von Biotensiden durch verschiedene Mikroorganismen wurde auf der Grundlage einiger allgemeiner Eigenschaften dieser Verbindungen, wie z. B. der Kollapstropfenmethode oder des Emulgierungsindex15, nachgewiesen, aber diese Methoden sind weder genau noch spezifisch16.

In dieser Arbeit beschreiben wir das Protokoll zum Nachweis von mRL und dRL durch die flüssige Extraktion von Gesamt-RL aus den Kulturüberständen verschiedener P. aeruginosa-Typ-Stämme und die Trennung beider RL-Typen mittels DC. Bei diesem Verfahren werden die aus dem Kulturüberstand extrahierten RL durch ihre unterschiedliche Löslichkeit in den für die DC-Behandlung verwendeten Lösungsmitteln getrennt, was zu einer differentiellen Migration auf der Kieselgelplatte führt. Daher haben mRL eine schnellere Migration als dRL und können als separate Flecken nachgewiesen werden, wenn die Platten getrocknet und mit α-Naphthol gefärbt werden.

Das hier beschriebene Verfahren zum Nachweis von mRL und dRL mittels TLC basiert auf einem bereits veröffentlichten Artikel17, der einfach durchzuführen ist und keine teure Ausrüstung erfordert. Diese Methode hat sich als nützlich für den Nachweis von RL in verschiedenen P. aeruginosa-Isolaten 13 unter Verwendung geeigneter Kontrollen erwiesen, wie z. B. einer von P. aeruginosa abgeleiteten Mutante, die nicht in der Lage ist, RL zu produzieren. Aufgrund ihrer mangelnden Spezifität ist sie jedoch nicht die bevorzugte Methode zur Charakterisierung neuartiger Biotenside, die von anderen Bakterien als Pseudomonas aeruginosa produziert werden.

Darüber hinaus wird eine Methode zur Quantifizierung der Rhamnose-Äquivalente der Gesamt-RL vorgestellt, die aus einem Überstand der P . aeruginosa-Kultur extrahiert wurde. Diese Methode quantifiziert diese Biotenside auf der Grundlage der Reaktion von Orcinol mit reduktiven Zuckern, was zu einem Produkt führt, das spektrophotometrisch bei 421 nm gemessen werden kann, wie zuvor beschrieben18. Da die Reaktion mit Orcinol nicht spezifisch für Rhamnose ist, ist es wichtig, diese Methode mit RL durchzuführen, das aus dem Kulturüberstand extrahiert wurde, der keine signifikanten Mengen anderer zuckerhaltiger Moleküle wie Lipopolysaccharide (LPS) enthält. Für die flüssige Extraktion von RL18 wird hier ein angesäuertes Chloroform/Methanol-Gemisch verwendet, aber auch Ethylacetat kann verwendet werden, und die Festphasenextraktion (SPE) liefert sehr gute Ergebnisse19. Die hier beschriebene Orcin-Methode erfordert keine ausgeklügelte Ausrüstung und kann zuverlässige Ergebnisse liefern, wenn sie, wie besprochen, bei der Vorbereitung der analysierten Proben mit besonderer Sorgfalt durchgeführt wird. Um eine ordnungsgemäße Probenvorbereitung zu gewährleisten, ist es wichtig, eine Pseudomonas aeruginosa rhlA-Mutante einzubeziehen, die nicht in der Lage ist, RL20 zu produzieren, und für jede Bestimmung drei biologische und drei technische Replikationen durchzuführen.

In der Literatur16,21 gab es erhebliche Kontroversen über die RL-Bestimmung mit der Orcin-Methode, wobei einige Studien darauf hindeuten, dass die RL-Produktion überschätzt wird und dass es dem Assay an Spezifität für Rhamnose mangelt, was möglicherweise zum Nachweis anderer Zucker führt. Wir zeigen hier jedoch, dass die beschriebenen Methoden unter den entsprechenden Bedingungen genau und spezifisch sein können. Darüber hinaus verwenden wir zum Vergleich mit den in diesem Artikel beschriebenen Verfahren die UPLC-MS/MS-Detektion eines dRL-Standards und zeigen, dass mit der Orcinol-Methode ähnliche Ergebnisse erzielt werden. Das detaillierte Protokoll zur Quantifizierung der RL mit dieser Methode ist in der Zusatzdatei 1 enthalten.

Diese Protokolle werden am Beispiel der Typstämme PAO1 (Phylogruppe 1), PA14 (Phylogruppe 2) und PA7 (Phylogruppe 3) veranschaulicht. Diese Stämme wurden ausgewählt, weil sie gut charakterisiert sind und unterschiedliche RL-Profile erzeugen.

Protocol

Dieses Verfahren ist in der ergänzenden Abbildung 1 schematisiert. Die für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt. 1. Nachweis von mRL und dRL in Kulturüberständen von P. aeruginosa mittels TLC Beginnen Sie mit der zentrifugierten Brühe des interessierenden Stammes P. aeruginosa , die 24 Stunden lang in flüssigem Medium kultiviert…

Representative Results

In diesem Artikel wurden drei verschiedene Stämme vom Typ P. aeruginosa verwendet, um drei Phylogruppen zu repräsentieren, jede mit unterschiedlichen RL-Produktionsniveaus und Anteilen von mRL und dRL. Zu diesen Stämmen gehören PAO1 (ein Wundisolat aus Australien, 195522), PA14 (ein Pflanzenisolat aus den USA, 197723) und PA7 (ein klinisches Isolat aus Argentinien, 201024). Als Negativkontrolle wurde die PAO1 rhlA-Mutante verwendet, die …

Discussion

Die genaueste Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von RL ist die HPLC gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS)7,8,27; Es erfordert jedoch spezielle und teure Geräte, die für viele Forscher möglicherweise nicht zugänglich sind. Die hier beschriebenen Methoden können routinemäßig mit grundlegenden Labormaterialien und -geräten durchgeführt werden, um RL-Konzentrationen zu ermitteln und abzuschätzen, aber sie weise…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Das Labor des GSCh wird teilweise durch Zuschüsse IN201222 des Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), der Dirección General de Asuntos del Personal Académico -UNAM unterstützt.

Materials

1-NAPHTHOL SIGMA-ALDRICH 70442
ACETIC ACID J.T. BAKER 9508-02
CENTRIFUGE For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM J.T. BAKER 9180-02
DRYING OVEN
ETHER J.T. BAKER 9244-02
GLASS PIPETTE SIGMA-ALDRICH CLS706510
HYDROCHLORIC ACID J.T. BAKER 5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE SIGMA-ALDRICH R-3875
METHANOL J.T. BAKER 9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE SIGMA-ALDRICH O1875
PPGAS Broth Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE) SIGMA-ALDRICH Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK FISHER SCIENTIFIC K4161801020
RHAMNOLIPIDS  SIGMA-ALDRICH R-90
SPECTROPHOTOMETER VIS
SPRAYER SIGMA-ALDRICH Z529710-1EA
SULFURIC ACID J.T. BAKER 9681-02
TES TUBES 5mL CORNING 352002
TLC SILICA GEL 60 F254 MERCK 1.05554.0001
WATER BATH > 80 °C

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González-Valdez, A., Hernández-Pineda, J., Soberón-Chávez, G. Detection and Quantification of Mono-Rhamnolipids and Di-Rhamnolipids Produced by Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (205), e65934, doi:10.3791/65934 (2024).

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