Detecção e quantificação de mono-ramnolipídios e di-ramnolipídios produzidos por Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria ambiental e um patógeno oportunista de grande preocupação devido à sua produção de características associadas à virulência e sua alta resistência a antibióticos ^1,2. Um metabólito secundário característico produzido por essa bactéria é o biossurfactante RL, que é produzido de forma coordenada com várias características associadas à virulência, como a fenazina piocianina, um antibiótico com atividade redox, e a protease elastase³. As propriedades tensioativas e emulsificantes do RL têm sido exploradas em diferentes aplicações industriais e atualmente são comercializadas⁴.

A maioria das cepas de P. aeruginosa, pertencentes aos filogrupos 1 e 2, produz dois tipos de RL: mRL, que consiste em uma porção de ramnose ligada a um dímero de ácido graxo principalmente de 10 carbonos, e dRL, que contém uma porção de ramnose adicional ligada à primeira ramnose⁴ (ver Figura 1). No entanto, foi relatado que dois filogrupos menores de P. aeruginosa (grupos 3 e 5) produzem apenas mRL ^5,6. Os dois tipos de RL contêm uma mistura de dímeros de ácidos graxos, que, como mencionado, são principalmente C10-C10, mas proporções menores de moléculas contendo dímeros C12-C10, C12-C12 e C10-C12:1 também são produzidas. A caracterização dos congêneres RL produzidos por diferentes cepas usando HPLC MS/MS tem sido relatada ^7,8. Os métodos descritos neste trabalho só podem diferenciar entre mRL e dRL, mas não podem ser usados para a caracterização dos congêneres RL.

P. aeruginosa e algumas espécies de Burkholderia são produtoras naturais de RL⁹, mas a primeira bactéria é a produtora mais eficiente. No entanto, o RL usado comercialmente é atualmente produzido em derivados de Pseudomonas putida KT2440 que expressam genes de P. aeruginosa para evitar o uso desse patógeno oportunista^10,11. A detecção e quantificação de RL produzidas por P. aeruginosa são de grande importância para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na expressão de características relacionadas à virulência¹², na caracterização de cepas pertencentes aos clados 3 ou 5¹³ e para a construção de derivados de P. aeruginosa que produzem esses biossurfactantes em excesso e reduzem a virulência¹⁴. A produção de biossurfactantes por diferentes microrganismos tem sido detectada com base em algumas características gerais desses compostos, como o método de queda por colapso ou índice de emulsificação¹⁵, mas esses métodos não são precisos nem específicos¹⁶.

Aqui, descrevemos o protocolo para detectar mRL e dRL usando a extração líquida de RL total dos sobrenadantes de cultura de diferentes cepas do tipo P. aeruginosa e a separação de ambos os tipos de RL usando TLC. Neste método, o RL extraído do sobrenadante de cultura é separado por sua solubilidade diferencial nos solventes usados para TLC, causando migração diferencial na placa de sílica gel. Assim, os mRL têm uma migração mais rápida do que os dRL e podem ser detectados como pontos separados quando as placas são secas e coradas com α-naftol.

O método aqui descrito para detecção de mRL e dRL por TLC é baseado em um artigo¹⁷ publicado anteriormente, que é de fácil execução e não requer equipamentos caros. Este método tem sido útil para detectar RL em vários isolados de P. aeruginosa ¹³ usando controles apropriados, como um mutante derivado de P. aeruginosa incapaz de produzir RL. No entanto, não é o método preferido para caracterizar novos biossurfactantes produzidos por bactérias diferentes de Pseudomonas aeruginosa devido à sua falta de especificidade.

Além disso, é apresentado um método para quantificar os equivalentes de ramnose do RL total extraído de um sobrenadante de cultura de P. aeruginosa . Esse método quantifica esses biossurfactantes com base na reação do orcinol com açúcares redutores, resultando em um produto que pode ser medido espectrofotometricamente a 421 nm, conforme descrito anteriormente¹⁸. Como a reação com orcinol não é específica da ramnose, é importante realizar esse método com RL extraído do sobrenadante da cultura que não contenha quantidades significativas de outras moléculas contendo açúcar, como lipopolissacarídeos (LPS). Uma mistura acidificada de clorofórmio / metanol é usada aqui para extração líquida de RL¹⁸, mas acetato de etila também pode ser usado, e a extração em fase sólida (SPE) produz resultados muito bons¹⁹. O método do orcinol aqui descrito não requer equipamentos sofisticados e pode fornecer resultados confiáveis se realizado com cuidado especial no preparo das amostras analisadas, conforme discutido. Para assegurar uma preparação adequada da amostra, é importante incluir um mutante de Pseudomonas aeruginosa rhlA incapaz de produzir RL²⁰ e realizar três réplicas biológicas e três réplicas técnicas para cada determinação.

Tem havido controvérsia significativa na literatura^16,21 em relação à determinação do RL pelo método do orcinol, com alguns estudos sugerindo que a produção de RL é superestimada e que o ensaio carece de especificidade para ramnose, potencialmente detectando outros açúcares. No entanto, demonstramos aqui que os métodos descritos podem ser precisos e específicos sob as condições apropriadas. Além disso, para comparação com os procedimentos descritos neste artigo, utilizamos a detecção UPLC-MS/MS de um padrão dRL e demonstramos que resultados semelhantes são obtidos com o método orcinol. O protocolo detalhado para quantificar a RL usando este método está incluído no Arquivo Suplementar 1.

Esses protocolos são exemplificados usando as cepas tipo PAO1 (filogrupo 1), PA14 (filogrupo 2) e PA7 (filogrupo 3). Essas cepas foram escolhidas por serem bem caracterizadas e produzirem diferentes perfis de RL.