الكشف عن وقياس الدهون الأحادية والدهون الثنائية التي تنتجها الزائفة الزنجارية

Pseudomonas aeruginosa هي بكتيريا بيئية وممرض انتهازي يثير قلقا كبيرا بسبب إنتاجها للسمات المرتبطة بالفوعة ومقاومتها العالية^{للمضادات} الحيوية ^1,2. المستقلب الثانوي المميز الذي تنتجه هذه البكتيريا هو RL الفاعل بالسطح الحيوي ، والذي يتم إنتاجه بطريقة منسقة مع العديد من السمات المرتبطة بالفوعة مثل فينازين بيوسيانين ، وهو مضاد حيوي له نشاط الأكسدة والاختزال ، والإيلاستاز البروتياز³. تم استغلال خصائص الشد النشط والاستحلاب ل RL في تطبيقات صناعية مختلفة ويتم تسويقها حاليا⁴.

تنتج معظم سلالات P. aeruginosa ، التي تنتمي إلى المجموعتين 1 و 2 ، نوعين من RL: mRL ، والذي يتكون من جزء واحد من rhamnose مرتبط بحمض دهني ثنائي بشكل أساسي من 10 ذرات كربون ، و dRL ، الذي يحتوي على جزء رامنوز إضافي مرتبط بالرامنوز^{الأول 4} (انظر الشكل 1). ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن أن مجموعتين صغيرتين من P. aeruginosa (المجموعتان 3 و 5) تنتجان فقط^{mRL 5,6}. يحتوي نوعان من RL على خليط من دايمرات الأحماض الدهنية ، والتي ، كما ذكرنا ، هي C10-C10 بشكل أساسي ، ولكن يتم أيضا إنتاج نسب أصغر من الجزيئات التي تحتوي على ثنائيات C12-C10 و C12-C12 و C10-C12: 1. تم الإبلاغ عن توصيف متجانسات RL التي تنتجها سلالات مختلفة باستخدام HPLC MS / MS ^7,8. يمكن للطرق الموصوفة في هذا العمل أن تفرق فقط بين mRL و dRL ولكن لا يمكن استخدامها لتوصيف متجانسات RL.

P. aeruginosa وبعض أنواع Burkholderia هي منتجة طبيعية ل RL⁹ ، لكن البكتيريا السابقة هي المنتج الأكثر كفاءة. ومع ذلك ، يتم إنتاج RL المستخدم تجاريا حاليا في مشتقات Pseudomonas putida KT2440 التي تعبر عن جينات P. aeruginosa لتجنب استخدام هذا العامل الممرض الانتهازي^10,11. إن الكشف عن RL التي تنتجها P. aeruginosa وقياسها الكمي لهما أهمية كبيرة لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في التعبير عن السمات المرتبطة بالفوعة¹² ، وفي توصيف السلالات التي تنتمي إلى clades 3 أو 5¹³ ، ولبناء مشتقات P. aeruginosa التي تفرط في إنتاج هذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي مع تقليل الفوعة¹⁴. تم الكشف عن إنتاج المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي بواسطة الكائنات الحية الدقيقة المختلفة بناء على بعض الخصائص العامة لهذه المركبات ، مثل طريقة إسقاط الانهيار أو مؤشر الاستحلاب¹⁵ ، ولكن هذه الطرق ليست دقيقة ولا محددة¹⁶.

هنا ، نصف بروتوكول الكشف عن mRL و dRL باستخدام الاستخلاص السائل لإجمالي RL من طافات الاستزراع لمختلف سلالات P. aeruginosa وفصل كلا النوعين من RL باستخدام TLC. في هذه الطريقة ، يتم فصل RL المستخرج من طافي الاستزراع عن طريق قابليتها للذوبان التفاضلي في المذيبات المستخدمة في TLC ، مما يتسبب في الهجرة التفاضلية على لوحة هلام السيليكا. وبالتالي ، فإن mRL لها هجرة أسرع من dRL ، ويمكن اكتشافها كبقع منفصلة عندما يتم تجفيف الألواح وتلطيخها ب α-naphthol.

تعتمد الطريقة الموضحة هنا للكشف عن mRL و dRL بواسطة TLC على مقالة منشورة مسبقا¹⁷ ، وهي سهلة الأداء ولا تتطلب معدات باهظة الثمن. كانت هذه الطريقة مفيدة للكشف عن RL في مختلف عزلات P. aeruginosa ¹³ باستخدام الضوابط المناسبة ، مثل طفرة مشتقة من P. aeruginosa غير قادرة على إنتاج RL. ومع ذلك ، فهي ليست الطريقة المفضلة لتوصيف المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي الجديدة التي تنتجها بكتيريا أخرى غير Pseudomonas aeruginosa بسبب افتقارها إلى الخصوصية.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة لتحديد مكافئات rhamnose لإجمالي RL المستخرج من طاف P. aeruginosa . تحدد هذه الطريقة كمية هذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي بناء على تفاعل الأورسينول مع السكريات المختزلة ، مما ينتج عنه منتج يمكن قياسه طيفيا عند 421 نانومتر ، كما هو موضح سابقا¹⁸. نظرا لأن التفاعل مع الأورسينول ليس خاصا بالرامنوز ، فمن المهم إجراء هذه الطريقة باستخدام RL المستخرج من طاف الثقافة الذي لا يحتوي على كميات كبيرة من الجزيئات الأخرى المحتوية على السكر ، مثل عديدات السكاريد الدهنية (LPS). يتم استخدام خليط الكلوروفورم / الميثانول المحمض هنا لاستخراج السائل من RL¹⁸ ، ولكن يمكن أيضا استخدام أسيتات الإيثيل ، واستخراج الطور الصلب (SPE) يعطي نتائج جيدة جدا¹⁹. لا تتطلب طريقة الأورسينول الموصوفة هنا معدات متطورة ويمكن أن توفر نتائج موثوقة إذا تم إجراؤها بعناية خاصة في إعداد العينات التي تم تحليلها ، كما تمت مناقشته. لضمان التحضير السليم للعينة ، من المهم تضمين طفرة Pseudomonas aeruginosa rhlA غير قادرة على إنتاج RL²⁰ وإجراء ثلاث نسخ بيولوجية وثلاث نسخ تقنية لكل تحديد.

كان هناك جدل كبير في الأدبيات^16،21فيما يتعلق بتحديد RL بواسطة طريقة orcinol ، مع بعض الدراسات التي تشير إلى أن إنتاج RL مبالغ فيه وأن الفحص يفتقر إلى خصوصية الرامنوز ، مما قد يكشف عن السكريات الأخرى. ومع ذلك ، فإننا نوضح هنا أن الطرق الموصوفة يمكن أن تكون دقيقة ومحددة في ظل الظروف المناسبة. علاوة على ذلك ، للمقارنة مع الإجراءات الموضحة في هذه المقالة ، نستخدم اكتشاف UPLC-MS / MS لمعيار dRL ونثبت أنه يتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام طريقة orcinol. ويرد البروتوكول المفصل لقياس RL كميا باستخدام هذه الطريقة في الملف التكميلي 1.

يتم تمثيل هذه البروتوكولات باستخدام سلالات النوع PAO1 (مجموعة الفيلوغروب 1) و PA14 (مجموعة الفيلوغروب 2) و PA7 (مجموعة الفيلو 3). تم اختيار هذه السلالات لأنها تتميز بشكل جيد وتنتج ملفات تعريف RL مختلفة.