Summary

Drosophila melanogaster Kullanarak Yaşa Bağlı Uyku Bozuklukları İçin Yüksek Verimli Küçük Moleküllü İlaç Taraması

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

Sunulan, yaşlı bir Drosophila modelinde meyve sineklerinin uyku davranışını izleyerek uykuyu iyileştirmek için yüksek verimli ilaç taraması için bir protokoldür.

Abstract

Sağlığın ve genel refahın önemli bir bileşeni olan uyku, genellikle kısa uyku süresi ve parçalanmış kalıplarla karakterize uyku bozuklukları yaşayan yaşlı bireyler için zorluklar sunar. Bu uyku bozuklukları ayrıca yaşlılarda diyabet, kardiyovasküler hastalıklar ve psikolojik bozukluklar dahil olmak üzere çeşitli hastalık riskinin artmasıyla da ilişkilidir. Ne yazık ki, uyku bozuklukları için mevcut ilaçlar, bilişsel bozukluk ve bağımlılık gibi önemli yan etkilerle ilişkilidir. Sonuç olarak, yeni, daha güvenli ve daha etkili uyku bozukluğu ilaçlarının geliştirilmesine acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Bununla birlikte, mevcut ilaç tarama yöntemlerinin yüksek maliyeti ve uzun deneysel süresi sınırlayıcı faktörler olmaya devam etmektedir.

Bu protokol, memelilere kıyasla yüksek oranda korunmuş bir uyku düzenleme mekanizmasına sahip bir tür olan Drosophila melanogaster’ı kullanan ve onu yaşlılarda uyku bozukluklarını incelemek için ideal bir model haline getiren uygun maliyetli ve yüksek verimli bir tarama yöntemini tanımlar. Yaşlı sineklere çeşitli küçük bileşikler uygulayarak, uyku bozuklukları üzerindeki etkilerini değerlendirebiliriz. Bu sineklerin uyku davranışları kızılötesi izleme cihazı kullanılarak kayıt altına alınmakta ve açık kaynak kodlu veri paketi Uyku ve Sirkadiyen Analiz MATLAB Programı 2020 (SCAMP2020) ile analiz edilmektedir. Bu protokol, uyku regülasyonu için düşük maliyetli, tekrarlanabilir ve verimli bir tarama yaklaşımı sunar. Meyve sinekleri, kısa yaşam döngüleri, düşük yetiştirme maliyetleri ve kullanım kolaylıkları nedeniyle bu yöntem için mükemmel konular olarak hizmet eder. Örnek olarak, test edilen ilaçlardan biri olan Reserpine, yaşlı sineklerde uyku süresini artırma yeteneğini gösterdi ve bu protokolün etkinliğini vurguladı.

Introduction

İnsanın hayatta kalması için gerekli olan temel davranışlardan biri olan uyku, iki ana durumla karakterize edilir: hızlı göz hareketi (REM) uykusu ve hızlı olmayan göz hareketi (NREM) uykusu1. NREM uykusu üç aşamadan oluşur: N1 (uyanıklık ve uyku arasındaki geçiş), N2 (hafif uyku) ve N3 (derin uyku, yavaş dalga uykusu), uyanıklıktan derin uykuyailerlemeyi temsil eder 1. Uyku hem fiziksel hem de zihinsel sağlıkta çok önemli bir rol oynar2. Bununla birlikte, yaşlanma yetişkinlerde toplam uyku süresini, uyku verimliliğini, yavaş dalga uyku yüzdesini ve REM uyku yüzdesini azaltır3. Yaşlı bireyler, yavaş dalga uykusuna kıyasla hafif uykuda daha fazla zaman geçirme eğilimindedir ve bu da onları gece uyanmalarına karşı daha duyarlı hale getirir. Uyanma sayısı arttıkça, ortalama uyku süresi azalır, bu da yaşlılarda parçalanmış bir uyku düzenine neden olur, bu da farelerdeHcrt nöronlarının aşırı uyarılmasıyla ilişkili olabilir 4. Ek olarak, sirkadiyen mekanizmalarda yaşa bağlı düşüşler, uyku süresinde daha erken bir kaymaya katkıda bulunur 5,6. Fiziksel hastalık, psikolojik stres, çevresel faktörler ve ilaç kullanımı ile birlikte, bu faktörler yaşlı yetişkinleri uykusuzluk, REM uykusu davranış bozukluğu, narkolepsi, periyodik bacak hareketleri, huzursuz bacak sendromu ve uykuda solunum bozukluğu gibi uyku bozukluklarına karşı daha duyarlı hale getirir 7,8.

Epidemiyolojik çalışmalar, uyku bozukluklarının yaşlılardadepresyon 10, kardiyovasküler hastalık11 ve demans12 dahil olmak üzere kronik hastalıklarla 9 yakından bağlantılı olduğunu göstermiştir. Uyku bozukluklarının ele alınması, kronik hastalıkların iyileştirilmesinde ve tedavi edilmesinde ve yaşlı yetişkinler için yaşam kalitesinin artırılmasında çok önemli bir rol oynar. Şu anda, hastalar uyku kalitesini artırmak için öncelikle benzodiazepinler, benzodiazepin olmayanlar ve melatonin reseptör agonistleri gibi ilaçlara güvenmektedir13. Bununla birlikte, benzodiazepinler, uzun süreli kullanımdan sonra reseptörlerin aşağı regülasyonuna ve bağımlılığa yol açabilir ve kesilme üzerine ciddi yoksunluk semptomlarına neden olabilir14,15. Benzodiazepin olmayan ilaçlar da demans16, kırıklar17 ve kanser18 dahil olmak üzere riskler taşır. Yaygın olarak kullanılan melatonin reseptörü agonisti ramelteon, uyku gecikmesini azaltır, ancak uyku süresini artırmaz ve kapsamlı ilk geçiş eliminasyonu nedeniyle karaciğer fonksiyonuyla ilgili endişeleri vardır19. Bir melatonin reseptörü agonisti ve serotonin reseptör antagonisti olan Agomelatin, depresyona bağlı uykusuzluğu iyileştirir, ancak aynı zamanda karaciğer hasarı riski taşır20. Sonuç olarak, uyku bozukluklarını tedavi etmek veya hafifletmek için daha güvenli ilaçlara acil ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, otomatik sistemler ve bilgisayar analizi ile birleştirilmiş moleküler ve hücresel deneylere dayanan mevcut ilaç tarama stratejileri pahalı ve zaman alıcıdır21. Reseptör yapısına ve özelliklerine dayanan yapıya dayalı ilaç tasarım stratejileri, reseptör üç boyutlu yapısının net bir şekilde anlaşılmasını gerektirir ve ilaç etkileri için öngörü yeteneklerinden yoksundur22.

2000 yılında, Campbell ve Tobler tarafından 1984’te önerilen uyku kriterlerine dayanarak 23, araştırmacılar, uyku benzeri durumlar sergileyen Drosophila melanogaster de dahil olmak üzere uyku24’ü incelemek için basit hayvan modelleri oluşturdular25,26. Drosophila ve insanlar arasındaki anatomik farklılıklara rağmen, Drosophila’da uykuyu düzenleyen birçok nörokimyasal bileşen ve sinyal yolu memeli uykusunda korunur ve insan nörolojik hastalıklarının incelenmesini kolaylaştırır27,28. Drosophila, sinekler ve memeliler arasındaki çekirdek osilatörlerindeki farklılıklara rağmen, sirkadiyen ritim çalışmalarında da yaygın olarak kullanılmaktadır 29,30,31. Bu nedenle Drosophila, uyku davranışını incelemek ve uyku ile ilgili ilaç taraması yapmak için değerli bir model organizma olarak hizmet eder.

Bu çalışma, yaşlı sinekler kullanılarak uyku bozukluklarını tedavi etmek için küçük moleküllü ilaçların taranması için uygun maliyetli ve basit fenotipe dayalı bir yaklaşım önermektedir. Drosophila’da uyku regülasyonu yüksek oranda korunur25 ve yaşla birlikte gözlenen uykudaki düşüş ilaç uygulaması ile geri dönüşümlü olabilir. Bu nedenle, bu uyku fenotipine dayalı tarama yöntemi, ilaç etkinliğini sezgisel olarak yansıtabilir. Sinekleri incelenen ilaç ve yiyecek karışımı ile besliyoruz, Drosophila Activity Monitor (DAM)32 kullanarak uyku davranışını izliyor ve kaydediyoruz ve elde edilen verileri MATLAB’daki açık kaynaklı SCAMP2020 veri paketini kullanarak analiz ediyoruz (Şekil 1). İstatistiksel analiz, istatistik ve grafik yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Örnek olarak, uykuyu arttırdığı bildirilen veziküler monoamin taşıyıcının küçük moleküllü bir inhibitörü olan Reserpin hakkında deneysel veriler sunarak bu protokolün etkinliğini gösteriyoruz33. Bu protokol, yaşa bağlı uyku problemlerini tedavi etmek için ilaçları tanımlamak için değerli bir yaklaşım sağlar.

Protocol

Bu protokol, Bloomington Drosophila Stok Merkezi’nden 30 günlük w1118 sineğini kullanır (BDSC_3605, bkz. 1. Yaşlı meyve sineklerinin hazırlanması Yemek hazırlama50 g/L mısır gevreği, 110 g/L şeker, 5 g/L agar ve 25 g/L mayayı karıştırarak standart mısır nişastası kültür ortamını hazırlayın. Mısır gevreğini ve mayayı jelatinleştirmek için suyla ısıtın ve ardından tüm maddeleri …

Representative Results

Reserpin, monoaminlerin presinaptik veziküllere geri alımını inhibe eden ve uykunun artmasına neden olan veziküler monoamin taşıyıcısının (VMAT) küçük moleküllü bir inhibitörüdür33. Reserpin’in uykuyu teşvik edici etkileri 30 günlük sineklerde incelendi ve kontrol grubu sadece çözücü dimetil sülfoksit (DMSO) ile beslendi. Reserpin grubunda, yaşlı sinekler, DMSO grubuna kıyasla hem gündüz hem de gece boyunca önemli ölçüde artmış uyku sergiledi. Şekil 5A, <str…

Discussion

Tarif edilen yöntem, küçük ve orta ölçekli uyku ilaçlarını hızlı bir şekilde taramak için uygundur. Şu anda, çoğu ana akım yüksek verimli ilaç tarama yöntemi biyokimyasal ve hücresel seviyelere dayanmaktadır. Örneğin, reseptörün yapısı ve özellikleri, ona bağlanabilen spesifik ligandları aramak için incelenir22. Başka bir yaklaşım, kütle spektrometresi35 ile Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) kullanılarak seçilen ilaçların moleküler fr…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Prof. Junhai Han’ın laboratuvar üyelerine tartışmaları ve yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından 32170970 YT’ye ve Jiangsu Eyaletinin “Siyanin Mavisi Projesi” tarafından ZCZ’ye desteklenmiştir.

Materials

Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

Referenzen

  1. Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
  2. Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
  3. Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
  4. Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
  5. Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
  6. Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
  7. Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
  8. Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
  9. Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons – an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
  10. Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
  11. Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
  12. Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer’s disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
  13. Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
  14. Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
  15. Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
  16. Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
  17. Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
  18. Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
  19. Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
  20. Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
  21. Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
  22. Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
  23. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep – a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
  24. Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
  25. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  26. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  27. Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
  28. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
  29. Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
  30. De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
  31. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  32. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
  33. Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
  34. Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
  35. Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
  36. Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
  37. Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
  38. Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
  39. Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
  40. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
  41. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
  42. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  43. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  44. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
  45. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).

View Video