यह विधि सीटू सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी और कोररिलेटिव लाइट एंड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (सीएलईएम) के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) ग्रिड की तैयारी के लिए एक सुलभ और लचीला प्रोटोकॉल प्रदान करती है।
सीटू सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी अपने मूल जमे हुए-हाइड्रेटेड सेलुलर संदर्भ में जटिल वस्तुओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, जिससे यह सेलुलर जीव विज्ञान और वायरोलॉजी के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है। अन्य माइक्रोस्कोपी तौर-तरीकों के साथ क्रायोटोमोग्राफी के संयोजन की क्षमता इसे एकीकृत और सहसंबंधित इमेजिंग के लिए एक आदर्श तकनीक बनाती है। हालांकि, सीटू सेलुलर टोमोग्राफी के लिए नमूना तैयारी सीधी नहीं है, क्योंकि कोशिकाएं इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर आसानी से संलग्न और फैली नहीं होती हैं। इसके अतिरिक्त, ग्रिड स्वयं नाजुक होते हैं और यदि बहुत बलपूर्वक संभाला जाता है तो टूट सकता है, जिसके परिणामस्वरूप छवि योग्य क्षेत्रों का नुकसान होता है। चिमटी के साथ ग्रिड में हेरफेर करते समय ऊतक संवर्धन व्यंजनों की ज्यामिति भी एक चुनौती पैदा कर सकती है। यहां, हम इन (और अन्य) चुनौतियों को दूर करने के लिए युक्तियों और चालों का वर्णन करते हैं और सीटू सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी और अनुयायी स्तनधारी कोशिकाओं के कोररिलेटिव इमेजिंग के लिए अच्छी गुणवत्ता वाले नमूने तैयार करते हैं। क्रायोमाइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकी में निरंतर प्रगति के साथ, यह तकनीक जटिल जैविक प्रणालियों की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए बहुत वादा करती है।
सीटू सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी एक शक्तिशाली तकनीक है जो रासायनिक निर्धारण के बिना कोशिकाओं में जैविक रूप से प्रासंगिक संरचनाओं के अध्ययन की अनुमति देती है। ईएम ग्रिड में कोशिकाओं को संलग्न करके और क्रायोजेन में ग्रिड को फ्रीज करके,इंट्रासेल्युलर पानी 1,2 से क्रिस्टलीय बर्फ के गठन के बिना रुचि की वस्तुओं को उनके प्राकृतिक सेलुलर संदर्भों में जमे हुए हैं। रासायनिक निर्धारण और क्रिस्टलीय बर्फ गठन दोनों प्रासंगिक अणुओं की संरचनाओं को बाधित कर सकते हैं, जैसे प्रोटीन और लिपिड,इन तकनीकों का उपयोग करके प्राप्त छवियों की जैविक सटीकता को कम कर सकते हैं। टोमोग्राफी में, ग्रिड को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वृद्धिशील कोणों पर चित्रित किया जाता है, और इन छवियों का उपयोग तब लक्षित क्षेत्र के त्रि-आयामी प्रतिनिधित्व के निर्माण के लिए किया जाताहै। सीटू क्रायोटोमोग्राफी का उपयोग एकीकृत और कोररिलेटिव इमेजिंग के लिए अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ किया जा सकता है, जैसे क्रायोफ्लोरेसेंस इमेजिंग, सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी, और क्रायोएफआईबी / एसईएम (क्रायोजेनिक फोकस्ड आयन बीम / स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) 6,7,8,9,10,11।. कई तकनीकों का एकीकरण किसी भी एकल माइक्रोस्कोपी तकनीक की तुलना में एक संरचना या प्रक्रिया के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देता है।
सीटू सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी के सभी लाभों के बावजूद, नमूना तैयार करना विभिन्न कारणों से चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है। उनकी नाजुकता के कारण, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड के बलपूर्वक हेरफेर से नुकसान हो सकता है, विशेष रूप से पतली कार्बन परत नाजुक और फटने का खतरा होता है, जिससे ग्रिड के छवि क्षेत्र कम हो जाते हैं। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड को उनके छोटे आकार के कारण हेरफेर करना भी मुश्किल होता है और कोशिकाओं को विकसित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कुओं या माइक्रोस्लाइड की सतह से अलग होने का खतरा होता है। कुओं या माइक्रोस्लाइड्स के भीतर ग्रिड का हेरफेर इनकी ज्यामिति के कारण मुश्किल साबित हो सकता है। ग्रिड की अनुचित तैयारी (उदाहरण के लिए, उन्हें तैरने की अनुमति देना) कम सेल घनत्व और संभावित इमेजिंग क्षेत्रों की संख्या को कम कर सकता है, खासकर जब कोशिकाएं स्वयं ग्रिड से जुड़ने के लिए प्रवण नहीं होती हैं। प्रत्यक्ष सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी के लिए, कोशिकाओं को बहुत पतला फैलना चाहिए, जो कई कारणों से बाधित हो सकता है, जिसमें अनुचित तापमान या ग्रिड की खुरदरी हैंडलिंग शामिल है।
विभिन्न प्रकार के अनुकूलन के माध्यम से, इस लेख में प्रस्तुत तकनीकें इन सबसे आम नुकसानों को संभालने के लिए हैं जो क्रायोटोमोग्राफी के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड की तैयारी के दौरान उत्पन्न होती हैं। 5/15 कोण वाले चिमटी का उपयोग अच्छी तरह से प्लेटों या माइक्रोस्लाइड के भीतर ग्रिड के हेरफेर की अनुमति देता है। चढ़ाना से पहले ग्रिड के दोनों किनारों पर लागू एक फाइब्रोनेक्टिन समाधान फ्लोटिंग ग्रिड को कम संभावना बनाता है, जो यह सुनिश्चित करने में फायदेमंद है कि ग्रिड में पर्याप्त सेल घनत्व है और हेरफेर के कारण ग्रिड क्षतिग्रस्त होने की संभावना कम है। ठंड से ठीक पहले तक ग्रिड को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके, हम यह भी सुनिश्चित करते हैं कि कोशिकाओं को एक आरामदायक वातावरण में रखा जाए ताकि कोशिकाओं को अपने पतले किनारों को वापस लेने से रोका जा सके। पीछे की तरफ से ग्रिड को ब्लॉटिंग करना यांत्रिक बल से कोशिकाओं को नुकसान को भी रोकता है। कुल मिलाकर, ये उपाय सीटू सेलुलर क्रायोटोमोग्राफी अध्ययनों के लिए नमूना तैयारी की सफलता दर को बढ़ाते हैं, जिससे इस इमेजिंग दृष्टिकोण की पहुंच बढ़ जाती है।
यहां, हमने सीटू क्रायोइलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी अनुप्रयोगों के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर बीज कोशिकाओं के लिए एक सुलभ, लचीला और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रदान किया है। इस विधि को डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों और / या प्रयोगात्मक आवश्यकताओं की जरूरतों को पूरा करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। महान लचीलेपन के अलावा, हमने एक वर्कफ़्लो का वर्णन किया है जो ग्रिड सीडिंग में आम नुकसान को अनुकूलित और कम करता है, विशेष रूप से कार्बन परत को व्यापक क्षति, कम सेल घनत्व, और पतले सेल अनुमानों की खराब संरचनात्मक अखंडता।
यद्यपि यहां वर्णित प्रोटोकॉल कई विकल्प प्रदान करता है, लेकिन कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिनका सामान्य परिणामों को अनुकूलित करने के लिए पालन किया जाना चाहिए। ग्रिड सेल सीडिंग के साथ सबसे बड़ी समस्याओं में से एक कुएं या माइक्रोस्लाइड से ग्रिड की टुकड़ी और फ्लोटिंग है। इसलिए, दोनों तरफ एक अनुगामी समाधान के साथ ग्रिड को पूरी तरह से गीला करना और इनक्यूबेशन अवधि के दौरान इसे सूखने से रोकना महत्वपूर्ण है। यदि 3 डी-मुद्रित ग्रिड धारकों का उपयोग कर रहे हैं, तो ध्यान रखें कि इन धारकों के लिए मीडिया के कई परिवर्तनों में फ्लोटिंग ग्रिड का उत्पादन करने की क्षमता है क्योंकि ग्रिड के नीचे फंसी हवा इसे धारक से बाहर निकाल सकती है।
चिमटी की हमारी पसंद व्यापक ग्रिड झुकने के बिना ग्रिड में हेरफेर करने का ज्यामितीय रूप से अनुकूल तरीका प्रदान करने के तरीके में ग्रिड की गुणवत्ता में भी सुधार करती है जो कार्बन परत को नुकसान पहुंचाएगी। गिरने से पहले कोशिकाओं को यथासंभव 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने से सेल पीड़ा कम हो जाती है और ग्रिड पर पतली छवि योग्य कोशिकाओं की संख्या में सुधार होता है। अंत में, सोने की तरफ से सोख्ता कोशिकाओं को कठोर यांत्रिक बलों से बचाएगा जो नाजुक सेलुलर संरचनाओं को नुकसान पहुंचा सकता है।
जबकि इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है, ग्रिड फोटो-माइक्रोपैटर्निंग को ग्रिड वर्ग14 के केंद्र में उनके लगाव को अनुकूलित करके छवि योग्य कोशिकाओं की संख्या बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। अंत में, 3 डी-मुद्रित ग्रिड धारकों का उपयोग हाल ही में प्रत्यक्ष ग्रिड हेरफेर12 को सीमित करके ग्रिड क्षति को कम करने के लिए किया गया है।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण हो सकता है कि यह प्रोटोकॉल क्रायोटोमोग्राफी के आवेदन के लिए कोशिकाओं से पतले किनारों और प्रोट्रूशियंस की इमेजिंग के लिए अनुकूलित है। हम प्रोटोकॉल में हमारी सिफारिशों से विभिन्न स्थितियों का समस्या निवारण करने का सुझाव देते हैं ताकि पसंद के डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए सर्वोत्तम परिणाम मिल सके। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल ग्रिड पर कोशिकाओं को सीडिंग करने की एक विश्वसनीय लेकिन बहुमुखी विधि प्रदान करता है जिसे विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए ट्विक किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम प्लांक-फ्रीजिंग उपकरण तक पहुंच के लिए मैंस्की प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम के कुछ हिस्सों को मिनेसोटा विश्वविद्यालय की लक्षण वर्णन सुविधा में किया गया था, जिसे सामग्री अनुसंधान विज्ञान और इंजीनियरिंग केंद्र (एमआरएसईसी) के माध्यम से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ) से आंशिक समर्थन प्राप्त होता है; पुरस्कार संख्या DMR-2011401) और राष्ट्रीय तंत्रिका विज्ञान पाठ्यक्रम पहल (NNCI; पुरस्कार संख्या ईसीसीएस -2025124) कार्यक्रम। हम वायरल वातावरण केंद्र (बी-एचआईवीई; 1यू54एआई170855-01) और ड्यूक सेंटर फॉर एचआईवी स्ट्रक्चरल बायोलॉजी (डीसीएचएसबी) में एचआईवी के व्यवहार से वित्त पोषण को धन्यवाद देना चाहते हैं; U54AI170752) केंद्र।
10 nm colloidal gold bead solution | Sigma-Aldrich | 741957 | |
6 well multidish, 100/CS | Fisher Scientific | FB012927 | |
Allegra V-15R Benchtop Centrifuge, IVD 120 V 60 Hz | Beckman-Coulter | C63125 | |
Au G300F1 with R2/2 Quantifoil carbon | Quantifoil | TEM-G300F1-AU | |
Bovine serum albumin | MilliporeSigma | A9647 | |
BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer improved | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
DMi1 Inverted Microscope | Leica | 22A00G119 | |
Dulbecco's modified eagle's medium – high glucose, no glutamine | Gibco | 11-960-044 | |
Dumont 5/15 tweezer | Electron Microscopy Sciences | 0103-5/15-PO | |
EM GP2 | Leica | 587085 | Automated plunge freezer |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5209 | |
Fibronectin from bovine plasma, cell culture grade | MilliporeSigma | F1141 | |
GenJet version II in vitro DNA transfection reagent | SignaGen Laboratories | SL100489 | |
GlutaMAX I 100x | Fisher Scientific | 35050061 | Media supplement |
Neslab EX-211 Heating Circulator | Neslab | Out of production | Water bath for media warming |
Original Portable Pipet-Aid Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-100 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
Pelco easyGlow device | Pelco | 91000S | Glow discharge device |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Media supplement |
Pipetman P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector | Gilson | F144059M | |
Pipetman P2, 0.2–2 µL, Metal Ejector | Gilson | F144054M | |
Pipetman P20, 2–20 µL, Metal Ejector | Gilson | F144056M | |
Whatman number 2 filter paper, 55 mm | Whatman | 28455-041 | Blotting paper |