晶状体皮层和晶状体核束和单纤维细胞的制备和免疫荧光染色

晶状体是眼睛前房中的透明卵形组织，由两种细胞类型组成，即上皮细胞和纤维细胞1（图1）。有一层单层上皮细胞覆盖晶状体的前半球。纤维细胞从上皮细胞分化而来，构成晶状体的大部分。高度特化的纤维细胞经历伸长、分化和成熟编程，其特征是从晶状体外围到晶状体中心的细胞膜形态发生明显变化 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ，也称为晶状体核。晶状体对从不同距离射入视网膜的光线进行精细聚焦的功能取决于其生物力学特性，包括刚度和弹性 13、¹⁴、15、16、17、^18、19。晶状体纤维的复杂交叉已被假设 20,21，最近被证明对晶状体刚度很重要 ^22,23。

图 1：晶状体纤维的晶状体解剖图和代表性扫描电子显微镜 （SEM） 图像。这幅漫画显示了上皮细胞前单层（浅蓝色阴影）和大量晶状体纤维细胞（白色）的纵向（从上到下从前到后）视图。晶状体的中心（粉红色阴影）被称为细胞核，由高度致密的纤维细胞组成。在右边，一幅横截面的卡通图显示了排列成蜂窝状的透镜纤维的细长六边形细胞形状。纤维细胞有两个宽边和四个短边。底部的代表性SEM图像显示了晶状体不同深度的晶状体纤维细胞之间的复杂膜状交叉。从右边看，晶状体周边新形成的透镜纤维沿短边有小突起，沿宽边有球窝（红框）。在成熟过程中，晶状体纤维会形成大的桨状结构域，这些桨状结构域由沿短边的小突起（蓝色框）装饰。成熟的纤维细胞具有大的桨状结构域，由小突起表示。这些互锁域对晶状体的生物力学特性很重要。晶状体核中的纤维细胞沿其短边具有较少的小突起，并具有复杂的榫槽状指（紫色框）。细胞的宽边显示球状膜形态。这幅漫画是从^22,32 修改而来的^，没有按比例绘制。比例尺 = 3 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

晶状体通过添加覆盖在前几代纤维^24,25 上的新纤维细胞壳来生长。纤维细胞具有细长的六边形横截面形状，具有两个宽边和四个短边。这些细胞从晶状体的前极延伸到后极，根据物种的不同，晶状体纤维的长度可以达到几毫米。为了支持这些细长和瘦小细胞的结构，沿着宽边和短边的专门的指状结构创造了互锁结构，以保持晶状体形状和生物力学特性。电子显微镜 （EM） 研究广泛记录了纤维细胞分化和成熟过程中细胞膜形状的变化 2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 .新形成的纤维细胞在其宽边上有球窝，短边有非常小的突起，而成熟纤维的短边有互锁的突起和桨。核纤维呈榫槽状交叉和球状膜形态。对于这些复杂的互锁膜所需的蛋白质知之甚少。以前关于纤维细胞中蛋白质定位的研究依赖于晶状体组织切片，这无法清晰地可视化复杂的细胞结构。

这项工作创造并完善了一种新方法，可以固定单个和成束的晶状体纤维细胞，以保持复杂的形态，并允许对细胞膜和细胞质内的蛋白质进行免疫染色。该方法忠实地保留了细胞膜结构，可与EM研究的数据相媲美，并允许使用特定蛋白质的一抗进行染色。我们之前对正在经历分化和成熟的皮质晶状体纤维进行了免疫染色^22,23。在该协议中，还有一种从晶状体细胞核染色纤维细胞的新方法。该协议为了解纤维细胞成熟和晶状体细胞核压实过程中膜指的形成和变化机制打开了大门。