Summary

In vitro Mapeamento químico de estruturas do DNA G-Quadruplex por bis-3-cloropiperidinas;

Published: May 12, 2023
doi:

Summary

Bis-3-cloropiperidinas (B-CePs) são sondas químicas úteis para identificar e caracterizar estruturas G-quadruplex em modelos de DNA in vitro. Este protocolo detalha o procedimento para realizar reações de sondagem com B-CePs e para resolver produtos da reação por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução.

Abstract

G-quadruplexes (G4s) são estruturas de DNA biologicamente relevantes, não canônicas, que desempenham um papel importante na expressão gênica e doenças, representando alvos terapêuticos significativos. Métodos acessíveis são necessários para a caracterização in vitro do DNA dentro de potenciais sequências formadoras de G-quadruplex (PQSs). B-CePs são uma classe de agentes alquilantes que provaram ser sondas químicas úteis para a investigação da estrutura de ordem superior dos ácidos nucléicos. Este trabalho descreve um novo ensaio de mapeamento químico explorando a reatividade específica de B-CePs com o N7 de guaninas, seguido de clivagem direta em Gs alquilada.

Ou seja, para distinguir as dobras G4 das formas de DNA desdobradas, usamos B-CeP 1 para sondar o aptâmero ligante de trombina (TBA), um DNA de 15 meros capaz de assumir o arranjo G4. A reação de guaninas que respondem a B-CeP com B-CeP 1 produz produtos que podem ser resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução (PAGE) em nível de nucleotídeo único, localizando adutos de alquilação individuais e clivagem de fita de DNA nas guaninas alquiladas. O mapeamento utilizando B-CePs é uma ferramenta simples e poderosa para a caracterização in vitro de sequências de DNA formador de G-quadruplex, possibilitando a localização precisa de guaninas envolvidas na formação de G-tétrades.

Introduction

Além da típica dupla hélice de Watson-Crick, os ácidos nucléicos podem adotar várias estruturas secundárias, como a forma alternativa G-quadruplex (G4), devido às suas sequências ricas em guanina. A estrutura G4 é baseada na formação de tetrâmeros planares, chamados de G-tétrades, nos quais quatro guaninas interagem através de ligações de hidrogênio Hoogsteen. As tétrades G são empilhadas e posteriormente estabilizadas por cátions monovalentes que são coordenados no centro do núcleo da guanina (Figura 1)1.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática de uma estrutura G-quadruplex (A) Representação esquemática de um G-tétrade. A matriz planar é estabilizada pelo pareamento de bases de Hoogsteen e por um cátion central (M+). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Sequências com quatro ou mais tiragens de pelo menos dois nucleotídeos guaninos consecutivos são potenciais sequências formadoras de G-quadruplex (PQSs) que podem dobrar em estruturas G-quadruplex . Os PQS estão localizados em diversos contextos celulares, como telômeros, promotores gênicos, DNA ribossomal e sítios de recombinação, e estão envolvidos na regulação de muitos processos biológicos2. Assim, a identificação e validação experimental de G4s no genoma humano, que atualmente é realizada principalmente por meio de ferramentas computacionais, é uma questão biologicamente relevante3. A fim de apoiar predições computacionais ou detectar estruturas G4 imprevisíveis, um método acessível baseado em mapeamento químico para identificar a formação de G4 em um molde de DNA é mostrado aqui, permitindo a identificação precisa de guaninas que formam a estrutura G-tétrade.

O ensaio de mapeamento químico relatado explora a reatividade diferente de bis-3-cloropiperidinas (B-CePs) com guaninas após a formação de estruturas G4. Devido à sua alta reatividade com nucleófilos 4,5,6,7,8,9, as B-CePs são agentes alquilantes de ácidos nucleicos com capacidade de reagir de forma muito eficiente com a posição N 7 dos nucleotídeos guanina10. A alquilação é seguida por depuração e clivagem de fitas em construções de DNA de fita simples e dupla. Pelo contrário, guaninas envolvidas na formação das G-tétrades em arranjos G4 são impermeáveis à alquilação B-CeP, já que a posição N7 das guaninas está implicada nas ligações de hidrogênio Hoogsteen. Essa reatividade específica dos B-CePs permite não apenas a detecção de estruturas G4, mas também a identificação das guaninas que formam a(s) tétrade(s), pois elas podem ser deduzidas de sua relativa proteção contra alquilação em comparação com guaninas em DNA de fita simples e dupla.

O protocolo de mapeamento químico é relatado aqui usando B-CeP 1 (Figura 2A) como sonda para a caracterização do aptâmero ligante de trombina (TBA), um DNA de 15 meros capaz de assumir o arranjo G4 na presença de cátions potássio11,12. O arranjo G4 do TBA (G4-TBA) é diretamente comparado com dois controles, a saber, TBA na forma de fita simples (ssTBA) e TBA recozido em sua sequência complementar para formar o construto de fita dupla (dsTBA) (Tabela 1). Os produtos das reações de sondagem são resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução (PAGE) no nível de nucleotídeo único, localizando adutos de alquilação individuais e clivagem de fita de DNA nas guaninas alquiladas. A visualização do gel é possibilitada pela conjugação do oligonucleotídeo TBA com um fluoróforo em sua extremidade 3′ (Tabela 1). Este protocolo mostra como dobrar TBA em suas diferentes conformações (G4 e controles), e como realizar reações de sondagem com B-CePs seguido de PAGE.

Protocol

1. Ácido nucleico e preparação de sonda química Ácidos nucleicosNOTA: O oligonucleotídeo denominado “TBA” é a sequência de DNA de 15 meros 5′-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3′ marcada na extremidade 3′ pelo fluoróforo 5-carboxifluoresceína (FAM) para permitir a visualização no gel. O oligonucleotídeo não marcado “cTBA” é sua sequência complementar de DNA 5′-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3′. A TBA e a CBT são empregadas para a obtenção das três diferentes estruturas, como mostra a Tab…

Representative Results

A Figura 2 mostra um resultado representativo de um ensaio de mapeamento químico realizado, conforme descrito no protocolo com B-CeP 1, sobre o oligonucleotídeo TBA dobrado em três estruturas diferentes. O arranjo G-quadruplex do TBA (G4-TBA) foi obtido dobrando o oligonucleotídeo em BPE e na presença do cátion K+, enquanto a forma de fita simples da mesma sequência de TBA (ssTBA) foi dobrada na ausência de potássio. O construto de fita dupla (dsTBA) foi preparado por rec…

Discussion

G-quadruplexos são estruturas secundárias de ácidos nucleicos que tipicamente se dobram dentro de sequências de DNA ricas em guanina, e são alvos significativos de pesquisa por causa de sua associação com controle genético e doenças. O mapeamento químico por B-CePs é um protocolo útil para a caracterização do DNA G4s, que pode ser usado para identificar as bases guaninas envolvidas na formação de G-tétrades sob condições fisiológicas salinas.

A sonda química utilizada nest…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Ciências Farmacêuticas e Farmacológicas da Universidade de Padova (PRIDJ-BIRD2019).

Materials

Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% Applichem A3658 R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/
24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS) Sigma Aldrich A7460
Analytical balance Mettler Toledo
Autoclave pbi international
Boric acid Sigma Aldrich B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R Sigma Aldrich B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate Fluka 71649
DMSO Sigma Aldrich 276855
DNA oligonucleotides Integrated DNA Technologies synthesis of custom sequences
EDTA disodium Sigma Aldrich E5134
Formamide Fluka 40248 H351-360D-373
Gel imager GE Healtcare STORM B40
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Micro tubes 0.5 mL Sarstedt 72.704
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541
Sequencing apparatus Biometra Model S2
Silanization solution I Fluka 85126 H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic Carlo Erba 480086
Speedvac concentrator Thermo Scientific Savant DNA 120
TEMED Fluka 87689 R11-21/22-23-34
Tris-HCl MERCK 1.08387.2500
Urea Sigma Aldrich 51456
UV-Vis spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 1000

Referenzen

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Sosic, A., Dal Lago, C., Göttlich, R., Gatto, B. In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines. J. Vis. Exp. (195), e65373, doi:10.3791/65373 (2023).

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