Modelo de paro cardíaco en ratón para la obtención de imágenes cerebrales y la monitorización de la fisiología cerebral durante la isquemia y la reanimación

El paro cardíaco (AC) sigue siendo una crisis de salud pública mundial¹. Más de 356,000 casos de AC fuera del hospital y 290,000 en el hospital se reportan anualmente solo en los EE. UU., y la mayoría de las víctimas de CA tienen más de 60 años. Cabe destacar que las alteraciones neurológicas post-AC son comunes entre los sobrevivientes, y representan un desafío importante para el manejo de la AC 2,3,4,5. Para comprender los cambios patológicos cerebrales post-AC y sus efectos en los resultados neurológicos, se han aplicado diversas técnicas de monitorización neurofisiológica y de tejido cerebral en pacientes 6,7,8,9,10,11,12. Utilizando espectroscopía de infrarrojo cercano, también se ha realizado un monitoreo cerebral en tiempo real en ratas CA para predecir resultados neurológicos¹³.

Sin embargo, en los modelos murinos de AC, este enfoque de imagen se ha complicado por la necesidad de compresiones torácicas para restaurar la circulación espontánea, lo que siempre implica un movimiento físico sustancial y, por lo tanto, dificulta los delicados procedimientos de imagen. Además, los modelos de AC se realizan normalmente con ratones en posición supina, mientras que los ratones deben girarse a la posición prona para muchas modalidades de imágenes cerebrales. Por lo tanto, en muchos casos se requiere un modelo de ratón con un movimiento corporal mínimo durante la cirugía para realizar imágenes/monitoreo en tiempo real del cerebro durante todo el procedimiento de AC, que abarca desde antes de la AC hasta después de la reanimación.

Anteriormente, Zhang et al. informaron de un modelo de CA de ratón que podría ser útil para la obtención de imágenes^{cerebrales 14}. En su modelo, la AC fue inducida por inyecciones en bolo de vecuronio y esmolol seguidas del cese de la ventilación mecánica. Demostraron que después de 5 min de AC, la reanimación se podía lograr mediante la infusión de una mezcla de reanimación. Sin embargo, cabe destacar que el paro circulatorio en su modelo se produjo sólo unos 10 segundos después de la inyección de esmolol. Por lo tanto, este modelo no recapitula la progresión de la AC inducida por asfixia en los pacientes, incluida la hipercapnia y la hipoxia tisular durante el período previo a la detención.

El objetivo general del procedimiento quirúrgico actual es modelar la asfixia clínica de la AC en ratones, seguida de la reanimación sin compresiones torácicas. Este modelo de AC, por lo tanto, permite el uso de técnicas de imagen complejas para estudiar la fisiología cerebral en ratones¹⁵.

Todos los procedimientos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el cuidado y uso de animales en investigación, y el protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Duke (IACUC). Para el presente estudio se utilizaron ratones machos y hembras C57BL/6 de 8-10 semanas de edad.

1. Preparación quirúrgica

1. Pese un mouse en una báscula digital y colóquelo en una caja de inducción de anestesia de plexiglás de 4 pulgadas x 4 pulgadas x 7 pulgadas.
2. Ajuste el vaporizador de anestesia a 5% de isoflurano, el medidor de flujo de oxígeno a 30 y el medidor de flujo de nitrógeno a 70 (consulte la Tabla de materiales).
3. Saque al animal de la caja de inducción y colóquelo en posición supina en el banco quirúrgico cuando su frecuencia respiratoria haya disminuido a 30-40 respiraciones por minuto.
4. Saca la lengua con unas pinzas romas y sujétala con la mano no dominante. Use la mano dominante para insertar un laringoscopio (ver Tabla de materiales) en la boca del ratón y visualice la cuerda vocal.
5. Use la mano no dominante para insertar un alambre guía y un catéter intravenoso de 20 G en la boca. Inserte suavemente el alambre guía en la tráquea.
6. Empuje el catéter dentro de la tráquea hasta que la parte del ala del catéter esté nivelada con la punta de la nariz.
   NOTA: No intuble a un ratón que no esté completamente anestesiado, ya que esto puede lesionar la tráquea y causar sangrado en las vías respiratorias.
7. Conecte el ratón intubado a un ventilador para animales pequeños (ver Tabla de materiales) y reduzca el isoflurano al 1,5%.
8. Introduzca el peso corporal del ratón en el panel de control del ventilador para determinar el volumen corriente y la frecuencia respiratoria.
9. Mantenga el ratón en posición supina bajo una lámpara de calor y mantenga la temperatura rectal a 37 °C con un controlador de temperatura.
10. Afeitar las áreas inguinales, desinfectar el área quirúrgica al menos tres veces con yodo y alcohol (ver Tabla de materiales) y cubrir el área con un paño quirúrgico estéril.
11. Aplique ungüento ocular en ambos ojos y administre 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea antes de la cirugía.
12. Abra el paquete de instrumentos estériles para la cirugía. Realice una incisión en la piel de 1 cm con unas tijeras quirúrgicas para acceder a las arterias femorales de ambos lados. Diseccionar y ligar la arteria femoral distal con una sola hebra de sutura de seda 4-0 (ver Tabla de materiales), y aplicar una gota de lidocaína.
13. Aplique una pinza para aneurisma en la arteria femoral proximal y haga una pequeña incisión en la arteria distal a la pinza. Inserte un catéter de polietileno 10 (PE-10, ver Tabla de materiales) en las arterias femorales izquierda y derecha.
    NOTA: La línea arterial izquierda se utiliza para la monitorización de la presión arterial, mientras que la derecha se utiliza para la extracción de sangre y la infusión de mezcla de reanimación.
14. Inyecte 50 μL de solución salina heparinizada 1:10 en cada vía arterial para evitar la formación de coágulos en la vía.
15. Gire el ratón a la posición prona y móntelo en un marco de cabeza estereotáxico.
16. Conecte tres electrodos de aguja (rojo, verde y negro) al brazo izquierdo, la pierna izquierda y el brazo derecho para el monitoreo del electrocardiograma (ECG, consulte la Tabla de materiales).
17. Pegue una sonda de fibra plástica flexible en el cráneo temporal intacto a través de una incisión en la piel de 0,5 cm para controlar el flujo sanguíneo cerebral. Este paso es opcional.
18. Afeitar la parte superior de la cabeza, desinfectar el área quirúrgica al menos tres veces con yodo y alcohol, y cubrir el área con un paño quirúrgico estéril.
19. Realice una incisión en la línea media de la piel de 2,5 cm y use cuatro retractores pequeños para exponer toda la superficie del cráneo para obtener imágenes cerebrales.
20. Coloque un generador de imágenes de monitoreo (p. ej., un generador de imágenes de contraste de manchas láser, consulte la Tabla de materiales) sobre la cabeza.
    NOTA: Se pueden agregar unas gotas de solución salina a la superficie del cráneo para facilitar la obtención de imágenes de contraste con manchas láser.

2. Inducción de paro cardíaco

1. Llene una jeringa de plástico de 1 ml con 26 μl de la solución madre del cóctel de reanimación.
   NOTA: Cada mililitro de esta solución contiene 400 μL de 1 mg/mL de epinefrina, 500 μL de bicarbonato de sodio al 8,4%, 50 μL de heparina de 1.000 U/mL y 50 μL de cloruro de sodio al 0,9% (ver Tabla de materiales).
2. Espere hasta que la temperatura corporal alcance los 37 °C. Ajuste el medidor de oxígeno al 100% para oxigenar la sangre durante 2 min.
3. Extraer la sangre arterial oxigenada hasta 200 μL a través de la arteria femoral derecha en la jeringa de plástico preparada que contiene 26 μL de solución madre de cóctel de reanimación.
4. Apague el oxígeno y aumente el nitrógeno al 100% para inducir la anoxia.
   NOTA: Después de aproximadamente 45 s, el corazón dejará de funcionar y la frecuencia cardíaca disminuirá rápidamente, lo que indica el inicio de la AC. Después de aproximadamente 2 minutos de privación de oxígeno, el monitoreo del ECG indicará una asistolia, y no habrá presión arterial sistémica medible y un flujo sanguíneo cerebral insignificante.
5. Apague el ventilador, el vaporizador de isoflurano, el controlador de temperatura y el medidor de flujo de nitrógeno. Ajuste el oxígeno al 100% en preparación para la reanimación.

3. Procedimiento de reanimación

1. Encienda el ventilador a los 8 minutos después del inicio de la AC.
2. Comience inmediatamente a infundir la sangre oxigenada extraída mezclada con el cóctel de reanimación en la circulación sanguínea a través de la arteria femoral derecha en 1 min.
   NOTA: La infusión conduce a un aumento gradual de la frecuencia cardíaca y al restablecimiento de la perfusión sanguínea; finalmente, se logra el retorno de la circulación espontánea (ROSC).

4. Recuperación posterior a la CA

1. Coloque el ratón en posición supina después de retirarlo del marco estereotáxico y retire los catéteres PE-10 de las arterias femorales.
2. Aplique bupivacaína al 0,25% en la incisión cutánea y sure las incisiones cutáneas con una sutura de nailon 6-0 (consulte la tabla de materiales). Aplique un ungüento antibiótico en la superficie de la incisión en la piel.
3. Desconecte el ventilador del ratón cuando se restablezca la respiración espontánea.
4. Transfiera el ratón a una cámara de recuperación con una temperatura controlada de 32 °C.
5. Después de 2 h de recuperación, extubar al ratón y devolverlo a la jaula de origen. Inyecte 0,5 ml de solución salina normal por vía subcutánea para prevenir la deshidratación.

Para inducir la AC, el ratón fue anestesiado con isoflurano al 1,5% y ventilado con nitrógeno al 100%. Esta afección condujo a una bradicardia severa en 45 s (Figura 1). Después de 2 minutos de anoxia, la frecuencia cardíaca se redujo drásticamente (Figura 2), la presión arterial disminuyó por debajo de 20 mmHg y el flujo sanguíneo cerebral cesó por completo (Figura 1). A medida que se apagaba el isoflurano, la temperatura corporal ya no se controlaba y descendía lentamente hasta unos 32 °C al final de la AC (Figura 1).

Inmediatamente después de 8 minutos de AC, se encendió el ventilador y se suministró oxígeno al 100% al ratón. La mezcla de sangre y reanimación se infundió en la circulación a través del catéter arterial. Poco después de la inyección de la mezcla de reanimación sanguínea, la función cardíaca comenzó a recuperarse. Después de un breve intervalo, se restableció el flujo sanguíneo sistémico y cerebral, y se estableció el RCE. La tasa de éxito de ROSC es de casi el 100% en nuestro laboratorio. Este modelo se ha realizado con éxito en ratones jóvenes y envejecidos.

Gracias a este modelo, se utilizaron dos modalidades de imagen en este estudio, que incluyen imágenes de contraste de manchas láser (LSCI) e imágenes fotoacústicas, para monitorear el flujo sanguíneo cerebral y la oxigenación de la sangre a nivel de todo el cerebro durante la AC y la reanimación. La LSCI confirmó la ausencia total de flujo sanguíneo en el cerebro durante la AC (Figura 3). A partir de las imágenes fotoacústicas se pueden obtener cambios más detallados en el flujo sanguíneo, la estructura y la oxigenación durante el procedimiento de AC (Figura 4).

Figura 1: Registro fisiológico durante la AC y la reanimación. El flujo sanguíneo cerebral (% basal; medido por flujometría láser Doppler), la presión arterial (mmHg), la actividad cardíaca (latidos por minuto) y la temperatura corporal (°C) cambian antes de la AC, durante la AC y después de la AC. El eje x representa el tiempo en minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Actividad cardíaca durante la AC y la reanimación. La frecuencia cardíaca se registró continuamente, y los paneles (A), (B) y (C) son representativos de la frecuencia cardíaca antes de la AC, durante la AC y después de la AC, respectivamente. El eje Y representa los valores absolutos de voltaje (mV). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes de contraste de manchas láser durante la AC y la reanimación. Se monitorizó el flujo sanguíneo cerebral global. La AC condujo a una pérdida completa del flujo sanguíneo cerebral (B) en comparación con el valor basal (A). La hiperperfusión estaba presente en el cerebro inmediatamente después de la reanimación (C), y luego fue seguida por hipoperfusión durante la fase tardía (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imágenes fotoacústicas durante la AC y la reanimación. Se accedió a los cambios vasculares locales mediante imágenes fotoacústicas. Las arterias y ramas no se perfundieron con sangre durante la AC (B) en comparación con la línea de base (A). Todas las arterias y ramas fueron perfundidas inmediatamente después de la reanimación, incluyendo incluso algunos pequeños puentes entre ramas (C, flechas). Sin embargo, estos puentes desaparecieron tardíamente (D) debido a la hipoperfusión. La barra muestra el nivel sO₂ . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En estudios experimentales de AC, se ha utilizado asfixia, inyecciones de cloruro de potasio o fibrilación ventricular derivada de corriente eléctrica para inducir AC 16,17,18,19,20,21,22,23. Normalmente, se requiere RCP para la reanimación en estos modelos de AC, especialmente en ratones. Hemos formulado una mezcla de reanimación que permite la reanimación espontánea después de la asfixia CA en ratones. La eliminación del paso de RCP abre más oportunidades para monitorear la fisiología cerebral durante la AC y la reanimación utilizando las modalidades de imágenes actuales.

Esta solución madre de cóctel de reanimación incluye bicarbonato de sodio, heparina, sangre arterial oxigenada y epinefrina. Es bien sabido que la AC induce acidosis tanto metabólica como respiratoria. Se espera que el bicarbonato de sodio normalice el pH en la sangre. La heparina es un anticoagulante y se usa para prevenir la formación de coágulos dañinos durante la reperfusión. La sangre oxigenada y la epinefrina son los componentes más críticos para la reanimación en este modelo. Aunque todavía se desconocen los mecanismos exactos que sustentan esta reanimación espontánea, se especula que cuando una cantidad adecuada de sangre oxigenada llega a las arterias coronarias, suministrando así oxígeno y epinefrina, se puede lograr la restauración de la contractilidad miocárdica y la generación de gasto cardíaco sin compresiones torácicas. En este proceso, la presión de infusión, que solo se puede alcanzar en la vasculatura arterial no colapsada y de paredes más gruesas, es crítica, ya que esto facilita el suministro de sangre oxigenada al corazón. En apoyo de esta noción, encontramos que la infusión de la misma mezcla a través de la vena femoral no resultó en la restauración de la función cardíaca y no se pudo lograr la reanimación. Por lo tanto, este cóctel de reanimación debe administrarse a través de la línea arterial para lograr la restauración de la función cardíaca sin compresiones torácicas.

La dosis de epinefrina utilizada en el modelo actual es similar a la que se utiliza en los experimentos estándar de AC. Cada mililitro de solución madre de cóctel de reanimación contiene 400 μg de epinefrina. La jeringa se prepara con 26 μL de solución madre de cóctel de reanimación, y la sangre arterial se extrae a 200 μL en la jeringa. Como la jeringa de plástico de 1 ml tiene un espacio muerto de 60 μl en la parte delantera, la sangre que queda en la jeringa después de la reanimación es de 60 μl, que incluye 6 μl de solución madre de cóctel de reanimación. Por lo tanto, la solución madre de cóctel de reanimación inyectada final es de 20 μL en cada ratón, lo que representa una dosis de 8 μg de epinefrina en este procedimiento. En este protocolo, la cantidad de solución de reanimación no se ajusta en función del peso corporal, de forma similar a como ocurre en los entornos clínicos. No hemos experimentado ningún problema de reanimación en ratones con un peso corporal de 20-32 g.

Cabe destacar que este protocolo de reanimación se utilizó con éxito solo en este modelo de AC de asfixia. En nuestro estudio piloto, este protocolo no logró resucitar ratones después de la AC inducida por KCl. Por lo tanto, el modelo descrito aquí es específicamente útil para estudiar la fisiología cerebral de la asfixia CA.

En resumen, dado que este modelo no requiere compresiones torácicas durante la reanimación, 1) el ratón se puede mantener en posición prona, y 2) la cabeza se puede montar en un marco de cabeza estereotáxico, lo que permite realizar mediciones de imagen y electrofisiológicas sin ningún movimiento durante toda la fase de grabación. Esto se ajusta perfectamente a los requisitos para la obtención de imágenes/monitorización de la fisiología cerebral durante la AC y la reanimación. Este modelo se ha utilizado con éxito en experimentos que tienen como objetivo rastrear dinámicamente el flujo sanguíneo cerebral, las respuestas vasculares y el oxígeno del tejido cerebral en ratones con AC, y estos experimentos han generado datos invaluables sobre los cambios vasculares y las respuestas a la administración de medicamentos en AC.