ここでは、光学系プラットフォームを用いてヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞において収縮性およびカルシウム測定を行う確立された方法について説明する。このプラットフォームにより、研究者は突然変異の影響とさまざまな刺激に対する応答を迅速かつ再現性のある方法で研究できます。
ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、突然変異を介した心筋細胞機能の変化を研究し、ストレッサーや薬物介入の影響を定義するための強力なツールです。本研究では、この光学系がhiPSC-CMの機能パラメータを2次元で評価するための強力なツールであることを実証した。このプラットフォームを使用することにより、異なるプレートレイアウトで保存状態の良い温度環境でペア測定を実行することができます。さらに、このシステムは研究者に即時のデータ分析を提供します。
本稿では、未修飾のhiPSC-CMの収縮性を測定する方法について述べる。収縮速度論は、250Hzのサンプリング周波数で緩和時に取得した参照フレームに対するピクセル相関の変化に基づいて、37°Cで測定されます。さらに、細胞内カルシウム過渡現象の同時測定は、Fura-2などのカルシウム感受性蛍光色素を細胞にロードすることによって取得できます。ハイパースイッチを使用して、収縮性測定の面積に対応する直径50μmの照明スポットでレシオメトリックカルシウム測定を実行できます。
心不全は世界中の主要な死因です。2019年、心血管疾患は世界で1,860万人の死亡を引き起こし、これは過去10年間で17.1%の増加を反映しています1。心不全を予防および治癒するための薬物標的を特定するための研究者の努力にもかかわらず、患者の転帰は依然として貧弱です2。ヒトに対する動物モデルの病態生理の違いは、心不全治療の最適化のための限られた成功の根本的な要因の1つである可能性があります3。疾患をモデル化し、新規薬物化合物の毒性と有効性をテストするために、追加の人間のようなモデルが保証されています。
ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、ストレッサー、虚血、代謝の変化、または病原性遺伝子変異によって誘発される細胞病態メカニズム、および薬物介入の有効性と毒性を定義するための強力なツールです4。hiPSC-CMの機能特性に対する効果を明らかにするには、細胞収縮の収縮期および拡張期特性を偏りのない再現性のある方法で測定する高速システムが必要です。今回の研究の全体的な目標は、光学系システムがhiPSC-CMの機能パラメータをリアルタイムで解析するための強力なツールであることを実証することです。
現在、hiPSC-CMの収縮性を評価するためのプラットフォームは複数あります。ただし、現在のシステムでは読み出しが遅いか、必要なセル数が課題になる可能性があります。ラベルフリービデオ測定システム5,6は、ビデオの事後分析に依存しているため、多くのストレージが必要であり、ビデオ取得中の直接フィードバックが不足しています。また、十分な時間分解能や空間分解能は達成が難しく、アンダーサンプリングにつながる可能性があります。蛍光レポーターを用いたクラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)/Cas9編集hiPSC-CMs7など、心筋細胞の特性を決定する他の方法は、細胞の遺伝子安定性を妨げる可能性があり、専門的な実験室の専門知識を必要とします。
上記の限界を克服するために、独自の光学ベースの測定システムを開発し、この研究で導入しました。このプラットフォームは、プレートサイズに制限なく、必要なプレートフォーマットに再メッキするだけで、未修飾のhiPSC-CMの収縮性測定を可能にします。さらに、リアルタイム測定により、hiPSC-CMの機能パラメータを直接観察および分析できるため、プロトコルを即座に調整および最適化するための実験設定が提供されます。さらに、各測定の場所が保存されるため、同じサンプルでペアの測定が可能になり、実験の検出力が向上します。
光学ベースのシステムを実証するために、対照hiPSC-CMラインで収縮性測定を実施しました。このコントロールhiPSC株は、正常な核型8を有する健康な男性ドナーの皮膚線維芽細胞から生成した。収縮速度論は、250Hzのサンプリング周波数での緩和中に取得された参照フレームに対するピクセル相関の変化に基づいて、37°Cで測定されました。収縮の正確な開始は必ずしも明確に決定できるとは限らないため、ピーク高さの20%に達した時点(ピークまでの時間20%)をピークまでの時間の測定の開始点としました。そうすることで、1つのサンプル内でこのパラメータの変動性が少なくなりました。同様に、信号がベースラインに戻る正確な瞬間を評価することは困難であるため、ピークからベースラインへの復帰の80%に達するのにかかった時間(ベースライン80%までの時間)を緩和時間を記述するために使用した。
全体的な収縮性測定には、静止拍動周波数、20%ピークからピーク収縮までの時間(TP。Con)、およびピーク収縮からベースラインの80%までの時間(TB。Con80)(図1B)。ストレッサーの効果を試験するために、細胞をイソプレナリン(ISO)と共にインキュベートした。加えて、収縮性測定と同時に、250Hzのサンプリング周波数で細胞にフラ−2−アセトキシメチルエステル(Fura−2AM)を負荷することによってCa2+過渡現象を測定した。 ハイパースイッチを用いたレシオメトリックCa2+測定9は、収縮性測定の面積に対応する直径50μmの照明領域上で行った。Ca2+測定データは、Ca2+過渡現象における20%ピークからピークまでの時間(TP.Ca)およびピークからベースラインの80%までの時間(TB.Ca80)として描かれる(図1C)。高速の自動データ分析ツールを使用して、各領域の平均収縮性およびカルシウム動態パラメータを生成しました。
本研究では、hiPSC-CMの収縮性およびカルシウム一過性測定を行い、これらの細胞に対するストレッサー/薬剤の影響を調べる方法について説明します。収縮性測定、レシオメトリックカルシウム測定、およびISOへの応答は、生物学的複製として3つの異なる分化ラウンドで実施されました。各生物学的複製について、テクニカル複製として3つのウェルで測定を実施した。この方法で測定を実行する理由は、サンプルとプラットフォームの生物学的変動性と技術的変動性を確実に評価できるようにするためです。適切な生物学的および技術的複製数を考慮することは別として、hiPSC-CM培養条件は、一定かつ堅牢な結果を得るために重要な役割を果たす可能性があります。測定中は、hiPSC-CMの年齢、培地の組成、再メッキ条件、化合物のインキュベーション時間などの基準と一致させることが重要です。この研究では、1つのウェルで11の領域を10秒間2回測定するのに平均568±24秒かかりました。これには、79 ± 11秒のISOインキュベーション時間が含まれます。これはウェルあたり約10分に短縮され、研究者は~4時間で完全な24ウェルプレートを測定できるはずです。気候制御は、安定したCO2を維持するために使用されます。これにより、化合物/ストレッサーがhiPSC-CMに及ぼす影響を高速に測定することができます。
iPSC-CMの収縮機能を測定するために、オプトジェネティクス13またはラベルフリーのビデオベースの顕微鏡5,6に依存するいくつかの既存のシステムがあります。オプトジェネティクスシステムは非常に複雑であり、電気物理学的および/または収縮性データを取得するために特別な技術が必要です。他のシステムは、ビデオの事後分析に依存しているため、多くのストレージが必要であり、ビデオ取得中の直接フィードバックがありません。また、十分な時間分解能や空間分解能が得られにくく、アンダーサンプリングが発生する可能性があります。同様に、蛍光レポーター7を用いたCRISPR/CAS-9編集hiPSC-CMは、心筋細胞の挙動に望ましくない影響を与える可能性があります。収縮緩和測定に蛍光色素を使用することも洗練されたアプローチですが、同じサンプルで長期間にわたって実験を行うことは制限されます14。
しかし、この光学ベースの測定プラットフォームは、蛍光色素や侵襲的な方法を使用せずに収縮緩和時間を測定するために使用できます。しかし、画素相関は空間情報を提供しないため、この方法では収縮の強さを測定することはできず、収縮と緩和の速度の変化を確実に検出することしかできません。導入した測定システムは温度制御されており、カルシウムと収縮性のデータを毎秒>200フレームの分解能でリアルタイムに取得できます。さらに、各測定の場所が保存されるため、ペアの測定が可能になり、実験の検出力が向上します。さらに、このプラットフォームは、研究者にデータを保存し、実験後すぐに分析する機能を提供します。全体として、この光学ベースの測定システムは、細胞の病態メカニズムを研究するための有望な方法であり、hiPSC-CMの機能に対する化合物の効果を評価でき、薬物スクリーニングの前臨床プロセスに役立つ可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
この研究の一部は、ユーロスターズ助成金Estars2 113937 CARDIOMYO(EM & DK)、およびNWO-VICI助成金91818602(JV)によって資金提供されています。
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm | ibidi | 82421 | |
B-27 Supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | |
CytoSolver transient analysis tool | CytoCypher | A fast automatic data analysis tool | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 11320033 | |
Fura-2, AM | Thermo Fisher | F1221 | |
Isoprenaline hydrochloride | Merck | 15627 | |
KnockOut™ Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828010 | |
Matrigel | Merck | CLS3542C | Basement membrane |
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software | CytoCypher | Optics-based measurement system | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI 1640 | Thermo Fisher | 11875119 | |
Tyrode | Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2 |