여기에서는 미토콘드리아 네트워크 스캐닝을 위한 컨포칼 현미경을 사용하여 생체 골격근 이미징에 의한 미토콘드리아 밀도 및 종단 분포의 변화를 분석하는 프로토콜을 제시합니다.
미토콘드리아는 세포의 대사 요구 사항에 따라 길어지고, 조각나고, 개조될 수 있는 세포 기관입니다. 미토콘드리아 네트워크의 리모델링은 건강한 미토콘드리아가 세포 요구를 충족시킬 수 있도록 합니다. 그러나 이 능력의 상실은 다른 병리학의 발달 또는 진행과 관련이 있습니다. 골격근에서 미토콘드리아 밀도와 분포 변화는 운동, 노화, 비만과 같은 생리학적, 병리학적 조건에서 관찰됩니다. 따라서 미토콘드리아 네트워크에 대한 연구는 이러한 조건과 관련된 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있도록 합니다.
여기에서는 쥐의 살아있는 골격근 섬유의 미토콘드리아 이미징을 위한 프로토콜이 설명됩니다. 섬유를 이완 용액에서 수동으로 절개하고 미토콘드리아의 형광 살아있는 세포 이미징 표시기(테트라메틸로다민 에틸 에스테르, TMRE)로 배양합니다. 미토콘드리아 신호는 근섬유간 미토콘드리아(IMF) 네트워크의 공초점 이미지를 얻기 위해 XYZ 스캔 모드를 사용하여 컨포칼 현미경으로 기록됩니다. 그 후, 컨포칼 이미지는 임계값 설정 및 이진화에 의해 처리됩니다. 이진화된 컨포칼 이미지는 미토콘드리아의 양의 픽셀을 설명하며, 이 픽셀은 미토콘드리아 밀도를 얻기 위해 계산됩니다. 골격근의 미토콘드리아 네트워크는 T-세뇨관(TT)과 유사한 주기적 종방향 분포를 갖는 IMF 집단의 밀도가 높은 것이 특징입니다. 고속 푸리에 변환(FFT)은 TT의 분포를 평가하기 위해 수행되는 표준 분석 기술로, 분포 빈도와 조직 수준을 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 골격근의 종방향 미토콘드리아 분포 분석을 위해 FFT 알고리즘의 구현이 설명됩니다.
미토콘드리아는 주로 신장(융합)과 단편화(분열) 사이의 균형에 의해 조절되는 매우 역동적인 네트워크를 형성합니다.1,2 미토푸신 1 및 2(Mfn1 및 Mfn2)와 같은 단백질의 발현과 활성에 의해 조절되고, 외부 미토콘드리아 막과 내막의 융합을 조절하는 시신경 단백질 위축1(Opa1)이 있습니다. 각각 1,2. 다이나민 관련 단백질(Drp1)은 Ser6163에서 인산화될 때 미토콘드리아 핵분열을 주로 조절합니다.
골격근에서 미토콘드리아 네트워크는 서로 다른 세포 영역(근섬유, 근종 및 핵)에 대한 근접성을 기반으로 구조적으로 잘 정의된 하위 집단으로 배열된다는 것이 잘 확립되어 있습니다.4,5. 유골 바로 아래에 위치한 미토콘드리아는 근근하 미토콘드리아(SSM)라고 하고, 수축 필라멘트 사이에 위치한 미토콘드리아는 근간미토콘드리아(IMF)라고 하며, 핵 주위의 미토콘드리아 하위집단을 핵주위 미토콘드리아 네트워크(PMN)라고 합니다. 더욱이, 이러한 미토콘드리아 하위 집단은 지역 특이적 기능을 가지고 있으며 대사적으로 특화되어 있는 것으로 제안되었습니다 4,5.
신진대사 및 수축 기능을 가능하게 하는 세포 에너지 항상성의 유지는 미토콘드리아 네트워크를 통한 특정 부위의 상호 작용 및 통신(예: IMF 및 SSM 상호 작용)에 크게 의존합니다.4,6. 미토콘드리아 네트워크 상호 작용 외에도 미토콘드리아는 다른 세포 기관과 상호 작용하여 구조적 및 기능적 복합체를 형성할 수 있습니다. 이와 관련하여, IMF는 근질 망상체(SR)에 인접해 있고 횡세관(TT)7에 의해 형성된 Ca2+ 방출 단위(CRU)에 근접할 수 있음이 밝혀졌다. 이 사실은 ATP 합성 및 세포 사멸을 조절하는 미토콘드리아 Ca2+ 흡수의 역할과 관련이 있습니다. 최근에, 세포질 Ca2+ 과도 현상을 조절하는 잠재적인 역할도 제안되었다8.
TT는 심근세포와 골격근섬유의 세로축을 따라 주기적으로 분포하는 유육종의 침범이다9,10, IMF 분포5와 유사하다. TT 분포의 변화는 수축 기능에서의 역할을 감안할 때 중요한 생리학적 의미를 갖습니다. 그러나 이러한 변화는 주로 심근세포에서 평가되었습니다. 고속 푸리에 변환(Fast Fourier Transform, FFT) 분석을 사용하면 거리 도메인에서 주파수 도메인으로 주기적 신호를 변환할 수 있으며, 그 결과 신호11,12,13의 주파수 및 규칙성을 나타내는 FFT 스펙트럼이 생성된다. 골격근 섬유의 미토콘드리아 네트워크 조직이 근육 손상 후 재생 중과 같이 다양한 대사 조건에 적응하는 데 필수적이라는 증거가 있지만(14,15), 대부분의 분석은 정성적으로 수행됩니다.
또한, 미토콘드리아 기능 장애가 여러 골격근 관련(예: 불사용 위축)2 및 비근육 질환, 특히 대사 질환 및 관련 근육량 손실(즉, 위축)16과 관련이 있다는 점을 감안할 때, 골격근의 미토콘드리아 네트워크 및 분포에 대한 정량적 평가가 관련성이 있습니다. 최근에는 비만군(Ob; Zucker fa /fa rats) 및 린 그룹(Lean; Zucker +/+ rats)는 FFT17을 통해 확인되었습니다. 이 연구는 미토콘드리아 분포를 분석하는 데 FFT의 유용성을 입증했습니다. 따라서 이 프로토콜은 형광 컨포칼 현미경으로 얻은 이미지에서 살아있는 골격근 섬유의 미토콘드리아를 연구하는 방법론을 제시합니다. 미토콘드리아 밀도는 배경 임계값에 의해 정량화되며, FFT 분석에 의한 종적 미토콘드리아 분포 분석도 설명됩니다. 워크플로 체계는 그림 1에 나와 있습니다.
미토콘드리아는 높은 리모델링 능력을 가진 세포 기관입니다. 미토콘드리아 역학(mitochondrial dynamics)1으로 알려진 미토콘드리아 융합 및 핵분열 메커니즘(mitochondrial fusion and fission mechanism)의 활성화와 미토콘드리아 전환 메커니즘(mitochondrial turnover mechanism) 사이의 균형, 즉 미토콘드리아 생물발생(mitochondrial biogenesis)과 특수 미토콘드리아 분해 경로(mitochondria degradation pathway, mitophagy21,22)를 통해 그 함량, 밀도 및 분포를 빠르게 수정할 수 있습니다. 미토콘드리아 함량과 형태는 세포 유형 및 발달 단계에 따라 달라질 수 있으며 다양한 생리학적 및 병리학적 자극하에서 리모델링될 수 있다 17,22,23,24. 따라서 미토콘드리아 형태학에 대한 연구는 반세기 이상 지속되어 왔다25. 특히, 전자현미경을 통한 미토콘드리아의 분석은 여러 연구에서 적용된 표준 기법이었다26.
컨포칼 현미경에 의한 형광 연구는 다양한 섬유 깊이에서 미토콘드리아의 살아있는 세포 이미징 능력으로 인해 지난 몇 년 동안 관련성을 얻었으며, 이는 다양한 적응 및 부적응 조건에서 골격근에서 미토콘드리아의 역할을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다27. 이 연구에서는 컨포칼 현미경에 의한 생체 골격근 섬유의 미토콘드리아 밀도 및 분포를 분석하는 방법론을 설명합니다. 살아있는 골격근 섬유를 다루는 주요 과제 중 하나는 미토콘드리아 공초점 기록까지의 분리 과정에서 수축을 방지하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해, 높은 Mg 및 ATP Relax 용액(17)을 사용하여 섬유를 최소 2시간 동안 이완된 상태로 유지하며, 이는 섬유 분리 프로세스, 형광단 부하 및 컨포칼 현미경에 의한 미토콘드리아 신호 획득을 수행하기에 충분한 시간을 제공합니다. 프로토콜의 중요한 점은 높은 정밀도와 신선한 조직이 필요하기 때문에 섬유를 기계적으로 얻는 것입니다. 그러나, 이전에 사용되고, 보고된 이러한 기술28을 사용하여 쥐 근육으로부터 생존 가능한 섬유 다발을 얻는 것이 가능하다. 온전한 섬유를 얻는 것은 sarcolemma 및 세포 내 환경을 보존하고, 세포 구조28,29 사이의 대사 및 기능적 누화를 유지할 수 있습니다.
조직이나 고정된 세포를 사용한 작업과 달리 컨포칼 현미경으로 살아있는 세포 이미징 형광 이미지를 획득하면 다양한 실험 조건의 효과를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 본 프로토콜은 실시간으로 미토콘드리아 밀도 및 분포의 변화를 탐색하고 Lean 및 Ob 유래 섬유 간의 예와 같이 실험 그룹 간의 차이점을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다(그림 3 및 그림 4). 살아있는 세포 이미징은 경미한 세포 손상으로 최적의 작업 조건을 표준화하는 것을 의미한다는 점을 항상 고려해야 합니다. 작업 시간, 사용된 솔루션의 품질, 획득 매개변수 및 레이저 노출을 미세하게 제어해야 합니다. 따라서 필수 고려 사항이 아래에 언급되어 있습니다.
근섬유의 미토콘드리아는 섬유의 크기와 장시간 레이저 노출로 인해 발생할 수 있는 섬유의 손상으로 인해 공초점 현미경으로 완전히 종단으로 기록할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고 섬유의 대표 샘플이 이 기술로 기록됩니다. 공초점 현미경으로 쥐의 골격근 섬유의 전체 두께를 기록할 수 있지만, 이는 기록 시간이 더 길고 레이저 빔에 노출된다는 것을 의미합니다. 대조군 쥐의 경우 이러한 기록에 문제가 발생하지 않았습니다. 그러나 병리학적 상태의 섬유는 Ob 쥐의 섬유에서 관찰되는 것처럼 손상에 더 취약할 수 있습니다. 결과적으로, 상이한 Z 거리에서 얻어진 대표적인 컨포칼 이미지의 스택을 획득하는 것이 바람직하다. 섬유 두께의 한 부분만 기록되는 경우, 미토콘드리아 분포와 밀도는 섬유 내 위치에 따라 달라질 수 있으므로 테스트한 모든 섬유에 대해 동일한 깊이로 스택을 채취하는 것이 좋습니다. IMF의 대표적인 컨포칼 이미지를 얻으려면 15μm 이상의 깊이에서 신호를 획득하는 것이 좋으며, 주변부에 가까운 SSM 집단을 피하는 것이 좋습니다.
공초점 획득 중에는 몇 가지 중요한 고려 사항을 고려해야 합니다. 먼저, 배율, 높은 NA 및 침지 매체를 고려한 침지 대물렌즈의 선택. 세포는 친수성 배양 배지에서 유지되기 때문에 배양 및 침지 배지의 굴절률은 좋은 신호를 얻고 조직 깊숙이 스캔하기 위해 유사해야 합니다. 일반적으로 침수 대물 렌즈를 사용하여 달성합니다. 그림 3 과 그림 4 의 컨포칼 이미지는 20x, 0.7NA, Water Immersion Objective로 획득했습니다. 이 대물렌즈를 사용하면 모든 깊이에서 광섬유를 기록할 수 있지만 높은 형광 강도 신호와 경미한 섬유 손상으로 IMF의 대표 공초점 이미지를 얻을 수 있기 때문에 15, 18 및 21μm에서 스캔하기로 결정했습니다. 40x 및 이멀젼 매체로서의 오일과 같은 다른 배율을 고려할 수 있지만 평가해야 합니다.
둘째, 이미징 획득을 위한 픽셀 크기는 나이퀴스트 정리(Nyquist theorem)에 따라 계산되며, 이를 통해 과잉 샘플링(더 높은 레이저 노출) 및 과소 샘플링(더 낮은 해상도로 이어짐)을 방지하는 적절한 픽셀 크기를 선택할 수 있습니다30. 계산은 선택한 대물 렌즈의 특성과 파장(~90nm)에 따라 다릅니다. 줌으로 조정할 수 있습니다. 따라서 하나의 줌 설정만 최적의 픽셀 크기(30)를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 실제로 줌은 분석할 표본의 영역에 따라 달라집니다. 따라서 균형을 찾으면 나이퀴스트 기준에 가장 가깝고 분석할 영역에 맞는 픽셀 크기로 작업할 수 있습니다. 그림 3 과 그림 4 는 150 및 190nm의 픽셀 크기로 획득되어 ~50-80μm인 섬유의 전체 너비를 분석할 수 있습니다.
셋째, 초점이 맞지 않는 빛이 감지기에 도달하는 것을 방지하는 적절한 핀홀 직경을 사용해야 합니다. 전형적으로, 1 Airy는 초점(30)의 평면으로부터 유래하는 광자의 ~80%의 검출을 허용하기 때문에 최적의 핀홀 크기로 간주된다. 그럼에도 불구하고, 낮은 형광 수준을 나타내는 일부 염색된 생물학적 샘플은 핀홀 증가(pinhole increase)를 필요로 한다(30). 그림 3 및 그림 4의 컨포칼 이미지는 더 낮은 Airy로 캡처된 낮은 신호로 인해 3 Airy의 핀홀 크기로 획득되었습니다. 핀홀 크기 증가로 인한 신호 강도 증가는 초점이 맞지 않는 캡처된 빛의 증가로 인해 해상도가 감소한다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 이러한 이유로 가능한 한 통풍이 잘되는 1에 가까운 핀홀 크기를 사용하는 것이 좋습니다.
적절하게 획득되면 공초점 이미지를 처리하여 미토콘드리아 밀도 및 분포에 대한 정량적 정보를 얻을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 임계점의 중요한 처리 이미지 단계는 신호의 정량화를 개선하기 위해 분석 전에 수행되어야 합니다. 이 중요한 단계에서 미토콘드리아의 양성 픽셀을 배경의 양성 픽셀과 분리하는 형광 강도 값이 정의됩니다. 임계값은 이미지의 히스토그램이 배경에 해당하고 다른 하나는 미토콘드리아에 해당하는 두 개의 피크를 표시할 때 미토콘드리아를 나타내는 피크의 가우스 피팅으로 정의할 수 있습니다. 그러나 각 이미지에서 바이모달 분포가 항상 달성되는 것은 아니므로 다른 임계값 방법을 적용해야 합니다.
이 프로토콜에서는 Otsu의 임계값 설정의 구현이 설명되는데, 이는 두 피크가 분리되지 않거나 다른 피크가 존재할 때 임계값을 찾도록 설계된 비모수적이고 감독되지 않은 방법입니다(31). Otsu는 생물학적 이미지 분석을 위한 오픈 소스 플랫폼을 사용하여 쉽게 적용할 수 있습니다. 그러나 다른 임계값 설정 방법을 테스트할 수 있습니다. 모든 컨포칼 이미지에 동일한 임계값 방법을 적용해야 하며 각 컨포칼 이미지에 대해 독립적으로 계산해야 합니다. 전체 스택에 임계값을 적용하면 잘못된 결과가 발생합니다. 임계값 설정 프로세스 후에 바이너리 이미지를 얻으면 이 프로토콜에 설명된 지침에 따라 미토콘드리아 밀도 및 FFT 분석을 쉽게 수행할 수 있습니다. 그러나 두 분석을 모두 수행할 때 정량화 오류가 발생할 수 있으므로 핵과 모세관을 포함하지 않도록 주의해야 합니다. 밀도와 관련하여 분석할 픽셀 또는 전체 면적에서 픽셀 또는 핵 또는 모세관이 차지하는 면적을 빼는 것으로 충분합니다. 또한 FFT 분석을 수행할 때 미토콘드리아 신호가 직선인지 확인해야 합니다. 반대로, 미토콘드리아 신호가 기울어지면 미토콘드리아 종방향 분포를 나타내지 않는 프로파일이 생성되어 잘못된 FFT 스펙트럼 데이터가 생성될 수 있습니다. 또한, 이미지의 노이즈를 줄이기 위해 전처리 단계를 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 중앙값 필터와 2D 디콘볼루션을 사용하는 두 가지 선택적 전처리 단계를 설명합니다. 이미지 및 미토콘드리아 밀도 함량에 대한 이러한 전처리 방법의 효과는 보충 그림 S1에 제시되어 있습니다. 이러한 전처리는 이미지 품질을 향상시킬 수 있지만 특정 이미지 세부 정보가 손실될 수도 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 따라서 주의해서 사용해야 하며 분석 중인 모든 이미지에 일관되게 적용해야 합니다.
그 장점에도 불구하고, 컨포칼 현미경은 획득을 위한 최적의 조건이 구현될 때 180-250nm의 측면 해상도(XY)에 의해 제한된다32. 미토콘드리아 직경은 ~200-700nm로 컨포칼 현미경의 회절 한계에 가깝습니다. 따라서, 미토콘드리아 이하 구조는 적절하게 검출될 수 없고(33 ) 이 프로토콜에 나타난 밀도 및 FFT 분석에 의해 평가될 수 없다. 확률적 광학 재구성 현미경(STORM), 유도 방출 공핍(STED) 나노스코피 또는 구조화된 조명 현미경(SIM)과 같은 현미경의 다른 초고해상도 기술을 탐색하여 미토콘드리아 하부 구조(32)를 분해할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 미토콘드리아의 공초점 이미지는 미토콘드리아 막 전위에 따라 달라지는 형광단 TMRE를 사용하여 얻습니다. 따라서 미토콘드리아 형광 강도는 막 전위에 따라 달라질 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 데이터 분석 전에 임계값 프로세스가 수행됩니다. 정의된 임계값을 초과하는 모든 픽셀은 형광 값과 관계없이 미토콘드리아 신호에 대해 양수로 간주됩니다. 그럼에도 불구하고 막 전위가 매우 낮은 미토콘드리아는 이 기술로 해결할 수 없다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 미토콘드리아 단백질 함량 정량화에 대한 보완 연구가 권장됩니다. TMRE를 사용하면 공초점 이미지를 미토콘드리아 막 전위 분석에도 사용할 수 있지만 카르보닐시아나이드-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존(FCCP)과 같은 분리제를 사용한 적절한 제어를 수행해야 한다는 장점이 있습니다. 또한 미토콘드리아 밀도 및 분포 분석에 대한 지침은 막 전위에 관계없이 미토콘드리아를 로드하는 미토콘드리아에 대한 녹색 형광 표시기를 사용하여 달성할 수 있지만 배양 전략 및 공초점 획득 설정을 표준화해야 합니다.
미토콘드리아 구조가 필수 미토콘드리아 및 세포 기능과 관련이 있다는 점을 감안할 때, 여기에 설명된 프로토콜은 질병 중 또는 특정 스트레스 모욕에 의한 미토콘드리아 리모델링에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 이는 에너지 생산과 같이 미토콘드리아에 의해 지배되는 골격근의 주요 기능이나 미토콘드리아가 수축-대사 결합과 같은 다른 세포 기관과 상호 작용하는 데 중요한 역할을 하는 골격근의 주요 기능을 더 잘 이해하는 데 기여할 수 있습니다. 프로토콜 지침을 따르면 살아있는 골격근의 미토콘드리아 밀도와 분포를 추정할 수 있습니다. 프로토콜 단계는 골격근 다발 절제, 컨포칼 현미경 스캐닝 및 이미지 분석에 중점을 둔 세 가지 주요 단계로 나뉘며, 여기에는 자세한 지침과 중요한 고려 사항이 포함됩니다. 특히, 이 프로토콜은 사용자의 필요에 따라 섬유 내에서 완전한 미토콘드리아 재건을 위한 추가 Z 단계를 탐색하도록 더욱 최적화될 수 있습니다. 예를 들어, 공초점 이미지 및 분석 단계를 테스트하여 살아있는 샘플과 고정 샘플의 TT와 같은 유사한 분포를 가진 세포 구조를 연구할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 의과대학과 몬테레이 공과대학의 비만 연구소의 지원을 받았습니다. 그림 3A 는 Scientific Image and Illustration 소프트웨어를 사용하여 만든 것입니다.
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A6419 | |
Borosilicate glass coverslip | Warner Instruments | 64-0709 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
Confocal microscope software Leica Application Suite | Leica | 2.7.3.9723 | |
Creatine Phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/ | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate | Sigma-Aldrich | 11240 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Forceps | Miltex | MH-18 | |
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective | Leica | 506517 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Iris scissors | Miltex | 5-304 | |
L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Maxchelator | UC Davis Health | https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm | |
Micro scissors | Miltex | 18-1633 | |
Open-source platform for biological-image analysis Fiji | Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji | https://fiji.sc/ | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
PSF Generator (PSF_Generator.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ | |
Recording chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Spreadsheet Microsoft Excel | Microsoft | ||
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Invitrogen | T669 |