تحليل كثافة الميتوكوندريا والتوزيع الطولي في ألياف العضلات والهيكل العظمي الحية للفئران بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لتحليل التغيرات في كثافة الميتوكوندريا والتوزيع الطولي عن طريق تصوير العضلات والهيكل العظمي الحي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر لمسح شبكة الميتوكوندريا.
Abstract
الميتوكوندريا هي عضية يمكن استطالها وتجزئتها وتجديدها وفقا لمتطلبات التمثيل الغذائي للخلايا. تسمح إعادة تشكيل شبكة الميتوكوندريا للميتوكوندريا الصحية بتلبية المتطلبات الخلوية. ومع ذلك ، فقد ارتبط فقدان هذه القدرة بتطوير أو تطور أمراض مختلفة. في العضلات الهيكلية ، لوحظت تغيرات في كثافة الميتوكوندريا وتوزيعها في الحالات الفسيولوجية والمرضية مثل التمارين الرياضية والشيخوخة والسمنة وغيرها. لذلك ، قد توفر دراسة شبكة الميتوكوندريا فهما أفضل للآليات المتعلقة بهذه الظروف.
هنا ، يتم وصف بروتوكول لتصوير الميتوكوندريا لألياف العضلات والهيكل العظمي الحية من الفئران. يتم تشريح الألياف يدويا في محلول مريح ويتم تحضينها بمؤشر تصوير الخلايا الحية الفلورية للميتوكوندريا (إستر إيثيل رباعي ميثيل رودامين ، TMRE). يتم تسجيل إشارة الميتوكوندريا بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام وضع المسح XYZ للحصول على صور متحدة البؤر لشبكة الميتوكوندريا بين الليفي العضلي (IMF). بعد ذلك ، تتم معالجة الصور متحدة البؤر عن طريق العتبة و binarization. تمثل الصورة متحدة البؤر ثنائية البؤر وحدات البكسل الموجبة للميتوكوندريا ، والتي يتم عدها بعد ذلك للحصول على كثافة الميتوكوندريا. تتميز شبكة الميتوكوندريا في العضلات الهيكلية بكثافة عالية من سكان صندوق النقد الدولي ، والتي لها توزيع طولي دوري مشابه لتوزيع الأنابيب التائية (TT). تحويل فورييه السريع (FFT) هو تقنية تحليل قياسية يتم إجراؤها لتقييم توزيع TT الذي يسمح بإيجاد تردد التوزيع ومستوى مؤسستهم. في هذا البروتوكول ، يتم وصف تنفيذ خوارزمية FFT لتحليل توزيع الميتوكوندريا الطولية في العضلات الهيكلية.
Introduction
تشكل الميتوكوندريا شبكات ديناميكية للغاية يتم تنظيمها بشكل أساسي من خلال التوازن بين استطالة (الانصهار) والتجزئة (الانشطار)1,2 ، والتي يتم تعديلها من خلال التعبير عن ونشاط البروتينات مثل Mitofusin 1 و 2 (Mfn1 و Mfn2) ، وضمور البروتين البصري 1 (Opa1) ، والتي تنظم اندماج غشاء الميتوكوندريا الخارجي والغشاء الداخلي ، على التوالي 1,2. ينظم البروتين المرتبط بالدينامين (Drp1) في الغالب انشطار الميتوكوندريا عندما يتم فسفرته في Ser6163.
في العضلات الهيكلية ، ثبت جيدا أن شبكة الميتوكوندريا مرتبة في مجموعات فرعية محددة جيدا من الناحية الهيكلية بناء على قربها من مناطق الخلايا المختلفة (اللييفات العضلية ، الساركوليما ، والنوى)4,5. تسمى تلك الميتوكوندريا الموجودة أسفل الساركوليما مباشرة الميتوكوندريا تحت اللقمة (SSM) ، وتسمى تلك الموجودة بين خيوط الانقباض الميتوكوندريا بين الليفي (IMF) ، وتسمى مجموعة الميتوكوندريا الفرعية حول النوى شبكة الميتوكوندريا المحيطة بالنواة (PMN). علاوة على ذلك ، فقد اقترح أن هذه المجموعات الفرعية للميتوكوندريا لها وظائف خاصة بالمنطقة وهي متخصصة في التمثيل الغذائي 4,5.
يعتمد الحفاظ على توازن الطاقة الخلوية ، والذي يسمح بوظيفة التمثيل الغذائي والانقباض ، إلى حد كبير على التفاعل والتواصل في مواقع محددة من خلال شبكة الميتوكوندريا (على سبيل المثال ، تفاعل IMF و SSM)4,6. بالإضافة إلى تفاعلات شبكة الميتوكوندريا ، يمكن أن تتفاعل الميتوكوندريا أيضا مع العضيات الأخرى ، وتشكل مجمعات هيكلية ووظيفية. في هذا الصدد ، تبين أن صندوق النقد الدولي يمكن أن يكون بجوار الشبكة الساركوبلازمية (SR) وعلى مقربة من وحدات إطلاق الكالسيوم2+ (CRU) ، التي تشكلها الأنابيب المستعرضة (TT)7. هذه الحقيقة ذات صلة بسبب دور امتصاص الميتوكوندريا Ca2+ في تنظيم تخليق ATP وموت الخلايا المبرمج. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح دور محتمل في تنظيم عابري Ca2+ الخلوي8.
TT هي غزوات الساركوليما التي لها توزيع دوري على طول المحور الطولي لخلايا عضلة القلب وألياف العضلات الهيكلية 9,10 ، على غرار توزيع صندوق النقد الدولي5. التغييرات في توزيع TT لها آثار فسيولوجية مهمة ، نظرا لدورها في وظيفة انقباض. ومع ذلك ، فقد تم تقييم هذه التغييرات بشكل رئيسي في خلايا عضلة القلب. يسمح استخدام تحليل تحويل فورييه السريع (FFT) بتحويل الإشارات الدورية من مجال المسافة إلى مجال التردد ، مما ينتج عنه طيف FFT يشير إلى تردد وانتظام الإشارة11،12،13. على الرغم من وجود أدلة على أن تنظيم شبكة الميتوكوندريا في ألياف العضلات الهيكلية أمر ضروري للتكيف مع الظروف الأيضية المختلفة ، كما هو الحال أثناء التجديد بعد إصابة العضلات14,15 ، يتم إجراء معظم التحليلات نوعيا.
بالإضافة إلى ذلك، وبالنظر إلى أن الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا قد ارتبط بالعديد من الأمراض المرتبطة بالعضلات والهيكل العظمي (على سبيل المثال، ضمور الإهمال)2 والأمراض غير العضلية، وخاصة الأمراض الأيضية، وما يرتبط بها من فقدان كتلة العضلات (أي الضمور)16، فإن التقييم الكمي لشبكة الميتوكوندريا وتوزيعها في العضلات الهيكلية له أهميته. في الآونة الأخيرة ، هناك اختلاف كبير في التوزيع الطولي للميتوكوندريا من ألياف العضلات gastrocnemius بين مجموعة السمنة (Ob; Zucker fa/fa rats) ، ومجموعة هزيلة (Lean; زوكر +/+ الجرذان) من خلال FFT17. أظهرت هذه الدراسة فائدة FFT في تحليل توزيع الميتوكوندريا. لذلك ، يقدم هذا البروتوكول منهجية لدراسة الميتوكوندريا في ألياف العضلات والهيكل العظمي الحية من الصور التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر البؤري الفلوري. يتم تحديد كثافة الميتوكوندريا من خلال عتبة الخلفية ، كما يتم وصف تحليل توزيع الميتوكوندريا الطولية بواسطة تحليل FFT. يتم تقديم مخطط سير العمل في الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
الميتوكوندريا هي عضيات ذات قدرة عالية على إعادة البناء. يمكن تعديل محتواها وكثافتها وتوزيعها بسرعة من خلال تنشيط آليات اندماج الميتوكوندريا والانشطار ، والمعروفة باسم ديناميكيات الميتوكوندريا1 ، والتوازن بين آليات دوران الميتوكوندريا: التكوين الحيوي للميتوكوندريا ومسار تحلل الميتوكوندريا المتخصص ، الميتوفاجي21,22. يمكن أن يختلف محتوى الميتوكوندريا والتشكل وفقا لنوع الخلية ومرحلة التطور ويمكن إعادة تشكيلها تحت محفزات فسيولوجية ومرضية مختلفة17،22،23،24. لذلك ، كانت دراسة مورفولوجيا الميتوكوندريا ذات صلة لأكثر من نصف قرن25. والجدير بالذكر أن تحليل الميتوكوندريا من خلال المجهر الإلكتروني كان التقنية القياسية المطبقة في دراسات متعددة26.
اكتسبت دراسات الفلورسنت بواسطة المجهر متحد البؤر أهمية في السنوات القليلة الماضية بسبب قدرتها على تصوير الخلايا الحية للميتوكوندريا في أعماق الألياف المختلفة ، والتي يمكن أن تساعد في فهم دور الميتوكوندريا في العضلات الهيكلية بشكل أفضل في ظروف التكيف وعدم التكيفالمختلفة 27. في هذه الدراسة ، تم وصف منهجية لتحليل كثافة الميتوكوندريا وتوزيعها في ألياف العضلات والهيكل العظمي الحية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. أحد التحديات الرئيسية للعمل مع ألياف العضلات والهيكل العظمي الحية هو تجنب الانكماش من عمليات العزل حتى تسجيل الميتوكوندريا متحد البؤر. لتحقيق هذا الهدف ، يتم استخدام محلول Mg و ATP Relaxعالي 17 للحفاظ على استرخاء الألياف لمدة 2 ساعة على الأقل ، مما يعطي وقتا كافيا لتنفيذ عملية عزل الألياف ، وحمل الفلوروفور ، واكتساب إشارة الميتوكوندريا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. النقطة الحرجة في البروتوكول هي الحصول على الألياف ميكانيكيا لأنها تتطلب دقة عالية وأنسجة جديدة. ومع ذلك ، فمن الممكن الحصول على حزم ألياف قابلة للحياة من عضلات الفئران باستخدام هذه التقنية المستخدمة سابقا والمبلغ عنها28. يسمح الحصول على ألياف سليمة بالحفاظ على الساركوليما والبيئة داخل الخلايا ، مع الحفاظ على الحديث المتبادل الأيضي والوظيفي بين هياكل الخلايا28,29.
على عكس العمل مع الأنسجة أو الخلايا الثابتة ، فإن الحصول على صور الفلورسنت لتصوير الخلايا الحية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر يسمح بالمراقبة في الوقت الفعلي لتأثير الظروف التجريبية المتنوعة. يمكن استخدام البروتوكول الحالي لاستكشاف التغيرات في كثافة الميتوكوندريا وتوزيعها في الوقت الفعلي واستكشاف الاختلافات بين المجموعات التجريبية ، مثل الأمثلة المعروضة هنا بين الألياف المشتقة من Lean و Ob (الشكل 3 والشكل 4). يجب دائما مراعاة أن تصوير الخلايا الحية يعني توحيد ظروف العمل المثلى مع تلف طفيف في الخلايا. يجب التحكم بدقة في وقت العمل وجودة الحلول المستخدمة ومعلمات الاستحواذ والتعرض لأشعة الليزر. ومن ثم ، فإن الاعتبارات الأساسية مذكورة أدناه.
لا يمكن تسجيل الميتوكوندريا من ألياف العضلات طوليا بالكامل بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر بسبب حجم الألياف وتلف الألياف التي يمكن أن تسببها التعرض الطويل لليزر. ومع ذلك ، يتم تسجيل عينة تمثيلية من الألياف تحت هذه التقنية. على الرغم من أنه من الممكن تسجيل سمك كامل للألياف العضلية الهيكلية للفأر عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ، فإن هذا يعني وقت تسجيل أطول والتعرض لشعاع الليزر. في حالة الفئران الضابطة ، لم تتم مواجهة مشكلات في هذه التسجيلات. ومع ذلك ، قد تكون الألياف من الحالات المرضية أكثر عرضة للتلف كما لوحظ في الألياف من فئران أوب. وبالتالي ، يفضل الحصول على مجموعة من الصور البؤرية التمثيلية التي تم الحصول عليها على مسافات Z مختلفة. عندما يتم تسجيل جزء فقط من سمك الألياف ، يوصى بأخذ المكدس بنفس العمق على جميع الألياف التي تم اختبارها نظرا لأن توزيع الميتوكوندريا وكثافتها يمكن أن تختلف وفقا لموقعها داخل الألياف. يوصى بالحصول على الإشارة على عمق يزيد عن 15 ميكرومتر للحصول على صور تمثيلية متحدة البؤر لصندوق النقد الدولي ، وتجنب مجموعات SSM الموجودة بالقرب من الأطراف.
أثناء الاستحواذ البؤري ، يجب مراعاة بعض الاعتبارات المهمة. أولا ، اختيار عدسة هدف الغمر مع مراعاة التكبير و NA العالي ووسط الغمر. نظرا لأنه يتم الاحتفاظ بالخلايا في وسط حضانة محبة للماء ، يجب أن يكون معامل الانكسار لوسط الحضانة والغمر مشابها للحصول على إشارة جيدة والمسح الضوئي العميق في الأنسجة. يتحقق عادة باستخدام عدسة موضوعية للغمر في الماء. تم الحصول على صور متحدة البؤر للشكل 3 والشكل 4 بهدف غمر الماء 20x ، 0.7 NA. يسمح هذا الهدف بتسجيل الألياف بكل عمقها ، ولكن تم تحديد المسح عند 15 و 18 و 21 ميكرومتر حيث يمكن الحصول على صور تمثيلية متحدة البؤر لصندوق النقد الدولي مع إشارة شدة مضان عالية وتلف طفيف في الألياف. يمكن النظر في التكبير الآخر ، مثل 40x والزيت كوسيط غمر ، ولكن يجب تقييمه.
ثانيا ، يتم حساب حجم البكسل لاكتساب التصوير وفقا لنظرية Nyquist ، والتي تسمح باختيار حجم بكسل مناسب يتجنب الإفراط في العينة (التعرض العالي لليزر) ونقص العينة (يؤدي إلى دقة أقل)30. يعتمد الحساب على خصائص العدسة الموضوعية المختارة والطول الموجي (~ 90 نانومتر). يمكن تعديله مع التكبير ؛ لذلك ، يوفر إعداد تكبير واحد فقط حجم بكسل مثالي30. ومع ذلك ، في الممارسة العملية ، يعتمد التكبير أيضا على مساحة العينة المراد تحليلها. وبالتالي ، فإن إيجاد التوازن يسمح بالعمل بحجم بكسل أقرب إلى معيار Nyquist ويناسب أيضا المنطقة المراد تحليلها. تم الحصول على الشكل 3 والشكل 4 بحجم بكسل 150 و 190 نانومتر ، مما سمح بتحليل العرض الكامل للألياف وهو ~ 50-80 ميكرومتر.
ثالثا ، يجب استخدام قطر ثقب مناسب يمنع الضوء خارج التركيز من الوصول إلى الكاشف. عادة ، يعتبر 1 Airy حجم الثقب الأمثل لأنه يسمح باكتشاف ~ 80٪ من الفوتونات الناشئة عن مستوى التركيز30. ومع ذلك ، فإن بعض العينات البيولوجية الملطخة التي تظهر مستويات مضان منخفضة تتطلب زيادة الثقب30. تم الحصول على صور متحدة البؤر من الشكل 3 والشكل 4 بحجم ثقب 3 Airy بسبب إشارة منخفضة تم التقاطها مع انخفاض Airy. من المهم مراعاة أن الارتفاع في شدة الإشارة الناتج عن زيادة حجم الثقب يؤدي إلى تقليل الدقة بسبب زيادة الضوء الملتقط خارج نطاق التركيز. لهذا السبب ، نوصي باستخدام حجم ثقب أقرب ما يمكن إلى 1 جيد التهوية.
عند الحصول على الصور متحدة البؤر بشكل كاف ، يمكن معالجتها للحصول على معلومات كمية عن كثافة الميتوكوندريا وتوزيعها. بغض النظر ، يجب تنفيذ خطوة صورة المعالجة الحرجة للعتبات قبل التحليل لتحسين القياس الكمي للإشارة. خلال هذه الخطوة الحاسمة ، يتم تحديد قيمة شدة التألق التي تفصل وحدات البكسل الموجبة للميتوكوندريا عن تلك الموجودة في الخلفية. يمكن تحديد العتبة من خلال ملاءمة غاوسية للقمة التي تمثل الميتوكوندريا عندما يعرض الرسم البياني للصورة قمتين ، واحدة تتوافق مع الخلفية والأخرى للميتوكوندريا. ومع ذلك ، لا يتم تحقيق التوزيع ثنائي النمط دائما في كل صورة من الصور ، لذلك يجب تطبيق طرق عتبة أخرى.
في هذا البروتوكول ، يتم وصف تنفيذ عتبة Otsu ، وهي طريقة غير معلمية وغير خاضعة للإشراف مصممة للعثور على قيمة العتبة عندما لا يتم فصل القمتين ، أو وجود قمم أخرى31. يمكن تطبيق Otsu بسهولة باستخدام منصة مفتوحة المصدر لتحليل الصور البيولوجية. ومع ذلك ، يمكن اختبار طرق العتبة الأخرى. يجب تطبيق نفس طريقة العتبة على جميع الصور متحدة البؤر ويجب حسابها بشكل مستقل لكل صورة متحدة البؤر. يؤدي تطبيق الحد على مكدس كامل إلى نتائج غير صحيحة. بمجرد الحصول على الصور الثنائية بعد عملية العتبة ، يمكن إجراء تحليل كثافة الميتوكوندريا و FFT بسهولة باتباع التعليمات الموضحة في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر عند إجراء كلا التحليلين لتجنب تضمين النوى والشعيرات الدموية ، لأنها قد تؤدي إلى أخطاء في القياس الكمي. فيما يتعلق بالكثافة ، يكفي طرح وحدات البكسل ، أو المساحة التي تشغلها النوى أو الشعيرات الدموية ، من وحدات البكسل أو المساحة الكلية المراد تحليلها. بالإضافة إلى ذلك ، عند إجراء تحليل FFT ، يجب التحقق من أن إشارة الميتوكوندريا مستقيمة. على العكس من ذلك ، عندما تميل إشارة الميتوكوندريا ، يمكن أن تنتج ملفات تعريف لا تمثل التوزيع الطولي للميتوكوندريا ، مما ينتج عنه بيانات طيف FFT غير صحيحة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق خطوة المعالجة المسبقة لتقليل الضوضاء في الصور. يصف هذا البروتوكول خطوتين اختياريتين للمعالجة المسبقة باستخدام مرشح متوسط وفك التفاف 2D. يتم عرض تأثيرات طرق المعالجة المسبقة هذه على الصورة ومحتوى كثافة الميتوكوندريا في الشكل التكميلي S1. من المهم مراعاة أنه على الرغم من أن هذه العمليات المسبقة يمكن أن تحسن جودة الصورة ، إلا أنها يمكن أن تؤدي أيضا إلى فقدان بعض تفاصيل الصورة. لذلك ، يجب استخدامها بحذر وتطبيقها باستمرار على جميع الصور التي يتم تحليلها.
على الرغم من مزاياه ، فإن الفحص المجهري متحد البؤر محدود بدقة جانبية (XY) من 180-250 نانومتر عند تنفيذ الظروف المثلى للاستحواذ32. قطر الميتوكوندريا ~ 200-700 نانومتر ، بالقرب من حد الحيود للفحص المجهري متحد البؤر ؛ وبالتالي ، لا يمكن اكتشاف الهياكل الفرعية للميتوكوندريا بشكل كاف33 ولا يمكن تقييمها من خلال تحليلات الكثافة و FFT الموضحة في هذا البروتوكول. يمكن استكشاف تقنيات أخرى فائقة الدقة للفحص المجهري ، مثل الفحص المجهري لإعادة البناء البصري العشوائي (STORM) ، أو التنظير النانوي لاستنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) ، أو الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية (SIM) ، لحل هياكل الميتوكوندريا الفرعية32. في هذا البروتوكول ، يتم الحصول على الصور متحدة البؤر للميتوكوندريا باستخدام الفلوروفور TMRE ، والذي يعتمد على إمكانات غشاء الميتوكوندريا. لذلك ، يمكن أن تختلف شدة الفلورسنت الميتوكوندريا وفقا لإمكانات غشائها. يتم تنفيذ عملية تحديد العتبة قبل تحليل البيانات للتغلب على هذه المشكلة. تعتبر جميع وحدات البكسل فوق عتبة محددة موجبة لإشارة الميتوكوندريا بغض النظر عن قيمتها الفلورية. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الميتوكوندريا ذات إمكانات الغشاء المنخفضة جدا لا يمكن حلها بهذه التقنية. وبالتالي ، يوصى بإجراء دراسات تكميلية لقياس محتوى بروتين الميتوكوندريا. ومن مزايا استخدام TMRE أنه يمكن أيضا استخدام الصور متحدة البؤر لتحليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا، ولكن يلزم إجراء ضوابط كافية مع عوامل الفصل مثل كاربونيل سيانيد-p-ثلاثي فلورو روميثوكسي فينيل هيدرازون (FCCP). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحقيق تعليمات كثافة الميتوكوندريا وتحليل التوزيع باستخدام مؤشرات الفلورسنت الخضراء للميتوكوندريا ، والتي تحمل الميتوكوندريا بغض النظر عن إمكانات الغشاء ، ولكن يجب توحيد استراتيجية الحضانة وإعدادات الاستحواذ متحد البؤر.
بالنظر إلى أن بنية الميتوكوندريا مرتبطة بوظائف الميتوكوندريا والخلوية الأساسية ، فإن البروتوكول الموصوف هنا يمكن أن يوفر معلومات قيمة حول إعادة تشكيلها أثناء المرض أو عن طريق إهانة إجهاد معينة. يمكن أن يساهم في فهم أفضل للوظائف الرئيسية للعضلات الهيكلية التي تحكمها الميتوكوندريا ، مثل إنتاج الطاقة ، أو التي تلعب فيها الميتوكوندريا دورا مهما في التفاعل مع العضيات الأخرى ، مثل اقتران الانكماش والتمثيل الغذائي. يسمح اتباع تعليمات البروتوكول بتقدير كثافة الميتوكوندريا وتوزيعها في العضلات الهيكلية الحية. تنقسم خطوات البروتوكول إلى ثلاث مراحل رئيسية تركز على تشريح حزمة العضلات الهيكلية ، والمسح المجهري متحد البؤر ، وتحليل الصور ، حيث يتم تضمين تعليمات مفصلة واعتبارات مهمة. والجدير بالذكر أنه يمكن تحسين البروتوكول بشكل أكبر لاستكشاف خطوات Z إضافية لإعادة بناء الميتوكوندريا بالكامل داخل الألياف وفقا لاحتياجات المستخدم. على سبيل المثال ، يمكن اختبار خطوات الصورة والتحليل متحد البؤر لدراسة الهياكل الخلوية ذات التوزيع المماثل ، مثل TT في العينات الحية والثابتة.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل كلية الطب ومعهد أبحاث السمنة في Tecnologico de Monterrey. تم إنشاء الشكل 3A باستخدام برنامج الصور العلمية والتوضيح.
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A6419 | |
| Borosilicate glass coverslip | Warner Instruments | 64-0709 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Confocal microscope software Leica Application Suite | Leica | 2.7.3.9723 | |
| Creatine Phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/ | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate | Sigma-Aldrich | 11240 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Forceps | Miltex | MH-18 | |
| HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective | Leica | 506517 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iris scissors | Miltex | 5-304 | |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Maxchelator | UC Davis Health | https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm | |
| Micro scissors | Miltex | 18-1633 | |
| Open-source platform for biological-image analysis Fiji | Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji | https://fiji.sc/ | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| PSF Generator (PSF_Generator.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spreadsheet Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Invitrogen | T669 |
Referenzen
- Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35 (2014).
- De Mario, A., Gherardi, G., Rizzuto, R., Mammucari, C. Skeletal muscle mitochondria in health and disease. Cell Calcium. 94, 102357 (2021).
- Chang, C. R., Blackstone, C. Dynamic regulation of mitochondrial fission through modification of the dynamin-related protein Drp1. Annals of the New York Academy of Sciences. 1201, 34-39 (2010).
- Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 757305 (2021).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial subpopulations and heterogeneity revealed by confocal imaging: possible physiological role. Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (5-6), 686-691 (2006).
- Díaz-Vegas, A. R., et al. Mitochondrial calcium increase induced by RyR1 and IP3R channel activation after membrane depolarization regulates skeletal muscle metabolism. Frontiers in Physiology. 9, 791 (2018).
- Boncompagni, S., et al. Mitochondria are linked to calcium stores in striated muscle by developmentally regulated tethering structures. Molecular Biology of the Cell. 20 (3), 1058-1067 (2009).
- Reggiani, C., Marcucci, L. A controversial issue: Can mitochondria modulate cytosolic calcium and contraction of skeletal muscle fibers. The Journal of General Physiology. 154 (9), e202213167 (2022).
- Heinzel, F. R., et al. Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium. Circulation Research. 102 (3), 338-346 (2008).
- Al-Qusairi, L., Laporte, J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skeletal Muscle. 1 (1), 26 (2011).
- Pérez-Treviño, P., Pérez-Treviño, J., Borja-Villa, C., García, N., Altamirano, J. Changes in T-tubules and sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes in early cardiac hypertrophy in a pressure overload rat model. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (4), 1329-1344 (2015).
- Celestino-Montes, A., Pérez-Treviño, P., Sandoval-Herrera, M. D., Gómez-Víquez, N. L., Altamirano, J. Relative role of T-tubules disruption and decreased SERCA2 on contractile dynamics of isolated rat ventricular myocytes. Life Sciences. 264, 118700 (2021).
- Song, L. S., et al. Orphaned ryanodine receptors in the failing heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4305-4310 (2006).
- Houzelle, A., et al. Human skeletal muscle mitochondrial dynamics in relation to oxidative capacity and insulin sensitivity. Diabetologia. 64 (2), 424-436 (2021).
- Call, J. A., et al. Ulk1-mediated autophagy plays an essential role in mitochondrial remodeling and functional regeneration of skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 312 (6), C724-C732 (2017).
- Fealy, C. E., Grevendonk, L., Hoeks, J., Hesselink, M. K. C. Skeletal muscle mitochondrial network dynamics in metabolic disorders and aging. Trends in Molecular Medicine. 27 (11), 1033-1044 (2021).
- Rivera-Alvarez, I., et al. A single session of physical activity restores the mitochondrial organization disrupted by obesity in skeletal muscle fibers. Life Sciences. 256, 117965 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2022).
- Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes, and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
- Meinild, L. A. -. K., et al. Exercise training increases skeletal muscle mitochondrial volume density by enlargement of existing mitochondria and not de novo biogenesis. Acta Physiologica. 222 (1), (2018).
- Memme, J. M., Erlich, A. T., Phukan, G., Hood, D. A. Exercise and mitochondrial health. Journal of Physiology. 599 (3), 803-817 (2021).
- Gan, Z., Fu, T., Kelly, D. P., Vega, R. B. Skeletal muscle mitochondrial remodeling in exercise and diseases. Cell Research. 28 (10), 969-980 (2018).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobon, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cell Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondria myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
- Mishra, P., Varuzhanyan, G., Pham, A. H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics is a distinguishing feature of skeletal muscle fiber types and regulates organellar compartmentalization. Cell Metabolism. 22 (6), 1033-1044 (2015).
- Cheng, A. J., Westerblad, H. Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca2+] in fully intact single skeletal muscle fibers. Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).
- Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal Muscles. International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2252 (2022).
- Pawley, J. B. Fundamental limits in confocal microscopy. In: Pawley, J. (eds) Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
- Otsu, N. A. Threshold selection method from gray-level histogram. IEEE Transactions on System Man Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Jakobs, S., Stephan, T., Ilgen, P., Brüser, C. Light microscopy of mitochondria at the nanoscale. Annual Review of Biophysics. 49, 289-308 (2020).
