이 논문은 C. elegans 를 원래 재배 플레이트에 한꺼번에 고정시키기 위한 냉각 단계를 구성하고 작동하기 위한 프로토콜을 설명합니다.
고해상도 생체 내 현미경 접근 방식은 모델 동물 예쁜꼬 마선충(예쁜 꼬마선충) 내부의 미묘한 정보와 미세한 세부 사항을 드러낼 수 있지만 이미지의 모션 블러를 방지하기 위해 강력한 동물 고정이 필요합니다. 안타깝게도 대부분의 최신 고정 기술은 상당한 수작업이 필요하므로 고해상도 이미징 처리량이 낮습니다. 예쁜꼬마선충 의 고정화는 전체 개체군을 재배 플레이트에 직접 쉽게 고정할 수 있는 냉각 접근 방식을 사용하여 크게 단순화됩니다. 냉각 단계는 재배 플레이트에 균일한 분포로 광범위한 온도를 설정하고 유지할 수 있습니다. 이 기사에서는 냉각 단계를 구축하는 전체 프로세스를 문서화합니다. 목표는 일반적인 연구원이 이 프로토콜에 따라 어려움 없이 실험실에서 작동 냉각 단계를 구축할 수 있도록 하는 것입니다. 세 가지 프로토콜에 따른 냉각 단계의 활용이 표시되며 각 프로토콜은 서로 다른 실험에 이점이 있습니다. 또한 최종 온도에 접근할 때의 스테이지의 냉각 프로파일과 냉각 고정을 사용하는 데 도움이 되는 몇 가지 팁이 나와 있습니다.
고해상도 광학 현미경은 세포 내 수준에서 생체 내 생물학적 구조를 연구하는 데 없어서는 안될 도구를 제공합니다. 많은 생물학적 연구는 뉴런 형태 1,2, 막 구조 3,4 및 단백질 국소화 5,6을 포함한 미묘한 해부학적 세부 사항을 해결하기 위해 서브미크론 해상도 이미징을 필요로 합니다. 고해상도 이미지는 이미징 양식과 프로브 7,8에 따라 수 밀리 초에서 몇 초의 노출 시간이 필요합니다. 최적의 결과를 얻으려면 현미경 기반 실험을 신중하게 계획하고 수행하는 것이 중요합니다. 이러한 노력에 중요한 것은 고해상도 이미징을 용이하게 하는 효율적인 동물 준비 방법입니다.
선충 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 많은 생물학적 과정을 연구하기 위해 널리 사용되는 모델 유기체이다9. 이 작은 동물은 일반적으로 선충 성장 배지(NGM) 한천 플레이트에서 재배되며 자가 수정을 통해 빠르게 번식하므로 대규모 연구에 적합합니다. 이들의 투명성과 다양한 라벨링 기술을 통해 내부 해부학10,11을 간단하게 시각화할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충의 미세 구조는 뉴런 재생(neuron regeneration)12, 뉴런 변성(neuron degeneration)13, 세포 분열(cell division)14과 같은 세포 내 수준에서 생물학적 과정을 연구하는 데 이상적이다. 이러한 연구는 서브미크론 해상도의 이미징과 이미지 흐림을 방지할 수 있을 만큼 충분히 강력한 동물 고정을 필요로 합니다. 강력한 고정화는 3D 이미지 스택(즉, z-스택) 및 타임랩스 이미징과 같이 공간 또는 시간에서 여러 이미지를 포함하는 기술에 특히 중요합니다. 노출 사이의 동물 움직임은 결과를 모호하게 할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충의 경우, 강력한 고정화는 일반적으로 개별 동물을 수동으로 조작하고 마취제를 사용하여 슬라이드에 장착하는 것을 포함합니다15,16. 이러한 시간과 노동 집약적인 절차는 대규모 실험을 매우 어렵게 만듭니다. 동물이 원래 재배 플레이트에 직접적이고 가역적으로 고정되는 고정화 전략은 고처리량 고해상도 이미징을 가능하게 할 수 있습니다.
예쁜꼬마선충의 냉각 고정화는 몇 가지 연구에서 밝혀졌지만 널리 활용되지는 않습니다. 그것은 일반적으로 동물17,18,19을 더 억제하기 위해 미세 유체 장치와 결합된다. 그러나 미세유체 장치는 복잡하고 상당한 작동 교육이 필요하며 예쁜꼬마선충 실험의 일반적인 고체 배양 워크플로와 쉽게 통합할 수 없습니다. 따라서 미세 유체 공학은 C. elegans 고정화에 널리 사용되지 않습니다. 여기에서 제시된 것은 Chung Laboratory의 최근 간행물20과 함께 이러한 단점을 해결하기 위해 열전 냉각 단계(그림 1)를 사용하는 새로운 냉각 고정 접근 방식의 도입입니다. 냉각 단계를 통해 일반적인 60mm 폴리스티렌 배양 플레이트는 -8°C에서 실온 사이의 목표 온도(T세트)로 냉각될 수 있습니다. 이러한 냉각 단계 접근법은 최소한의 사용자 노력으로 전체 동물 개체군을 쉽고 가역적으로 고정시킬 수 있으며, 동물 처리 시간(20)의 98%를 제거할 수 있다.
아래에서는 처음부터 냉각 단계를 구축하는 절차에 대해 설명합니다. 부품 가공 및 3D 프린팅을 제외하고 전체 절차는 특별한 도구나 전문 지식 없이 4시간이 소요될 것으로 예상됩니다. 그런 다음 다양한 냉각 속도를 가진 세 가지 다른 냉각 전략과 일반적인 정립 현미경에서 예쁜꼬마선충 을 고정시키려는 사용자의 노력에 대해 자세히 설명합니다. 기본 설정 전략은 사용자 응용 프로그램에 따라 달라질 수 있습니다. 이러한 세 가지 냉각 고정화 전략에 대한 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.
냉각 단계 제조, 조립 및 사용법이 이 원고에 나와 있습니다. 대부분의 구성 요소는 온라인으로 구입할 수 있는 기성품입니다. 동판 및 사파이어 창과 같은 일부 구성 요소는 맞춤 주문이 필요하며 제작하는 데 최대 1개월이 소요될 수 있습니다. 3D 프린팅이 가능한 다른 구성 요소는 대부분의 연구 기관에서 쉽게 제작할 수 있습니다(보충 표 1). 조립 공정은 몇 가지 도구만 있으면 되며 비전문가도 몇 시간 안에 신속하게 완료할 수 있습니다. 따라서 대부분의 생물학 실험실은 이 장치를 쉽게 구현할 수 있어야 합니다.
냉각 단계 및 냉각 고정화 접근법은 기존 고정화 방법에 비해 몇 가지 중요한 개선 사항을 가지고 있으며, 이는 원래 간행물20에 자세히 설명되어 있습니다. 간단히 말해서, 냉각 단계는 배아와 다우어를 포함한 모든 연령대의 많은 C. elegans 개체군을 표준 현미경 워크플로 하에서 일반적인 배양 플레이트에 강력하게 고정할 수 있도록 합니다. 미세 유체 공학과 같은 복잡한 하드웨어 설정이 필요하지 않으며 더 강력한 고정 효과를 제공합니다. 또한 화학 물질을 사용하지 않기 때문에 동물과 연구자에 대한 독성 화학 물질 노출을 최소화하는 동시에 유사한 고정 효과를 제공합니다. 이러한 기술적 기능을 통해 이 장치를 광범위하게 적용할 수 있으며 많은 수의 동물에 대한 고해상도 생체 내 현미경이 필요한 많은 실험에 접근할 수 있습니다.
장치를 만드는 동안 모든 열 페이스트 적용과 사파이어 창을 쿠퍼 플레이트에 고정하기 위한 넓은 테이프를 포함하여 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 열 페이스트는 틈을 낮은 열 저항 재료로 대체하여 강력한 열 전도성을 보장합니다. 원하는 냉각 성능을 달성하려면 구리판에 대한 Peltier 저온 표면, 구리 냉각 블록에 대한 Peltier 고온 표면, 사파이어 창에 대한 동판을 포함하여 모든 맞닿는/접촉 표면 사이에 페이스트를 적절하게 도입해야 합니다. 무대에 적용된 넓은 테이프는 구리판을 격리하여 공기와 결로로 인한 가열을 방지하여 녹을 유발합니다. 또한 사파이어 창과 구리판 사이의 연결을 강화합니다. 따라서 열 페이스트와 와이드 테이프를 적용하는 경우 모두 각별한 주의가 필요합니다.
실제 냉각 고정 실험에서 전압 및 시간과 같은 이 원고에 제공된 매개변수는 플레이트 내 한천의 양, 스테이지의 효율성, 주변 온도 및 습도와 같은 배양 플레이트 및 스테이지의 특정 특성에 따라 달라집니다. 향후 수정에서는 PID(Proportional-Integral-Derivative)와 같은 피드백 컨트롤러를 설치하여 냉각 단계에 입력되는 전압을 능동적으로 조정하여 원하는 온도를 달성하고 안정화할 수 있습니다.
이러한 냉각 단계 고정화에는 몇 가지 한계가 있으며, 이는 최초 간행물20에 자세히 설명되어 있다. 간단히 말해서, 다른 온도에서 자란 동물은 다른 정도로 고정되어 추가 미세 조정이 필요할 수 있습니다. 또한 이 전류 냉각 stage는 도립 현미경용으로 설계되지 않았습니다. 또한, 배양 플레이트 상의 이미징 또는 스크리닝은 플레이트에 오염을 도입할 수 있다.
우리는 복합 정립 현미경 및 도립 현미경을 포함한 다양한 이미징 플랫폼에 적합한 새로운 버전의 냉각 스테이지를 설계하고 있습니다. 이러한 새로운 디자인은 이러한 플랫폼에서 이미징하는 동안 배양 플레이트에 직접 동물 냉각 고정을 허용합니다. 이러한 냉각 단계의 이미징은 직립 구성과 유사한 긴 작동 거리의 공기 침수 대물렌즈를 사용합니다. 오늘날 공기 침지 대물렌즈는 최대 0.9의 개구수를 가질 수 있으며, 이는 녹색 형광 단백질 이미징을 위한 약 300nm 해상도를 제공합니다. 따라서 새로운 냉각 단계와 현미경의 조합은 서브미크론 해상도의 형광 이미징을 일상적으로 허용할 수 있습니다.
또한 경험에 따라 냉각 단계를 사용하는 데 도움이 되는 몇 가지 팁을 제공합니다. 예를 들어, 개인은 수냉식 어셈블리 내부에 기포가 있는지 확인해야 합니다. 기포는 펠티에 고온 표면으로의 냉각을 저하시켜 냉각 단계의 냉각 효율을 저하시킵니다. 기포가 있는 경우 12V 전원 공급 장치를 켜서 물이 흐르도록 하고 물 흐름의 모든 구성 요소를 흔들어야 합니다. 갇힌 영역에서 기포를 배출하고 펌프 탱크에서 배출할 수 있습니다. 연구원은 수냉식 어셈블리를 조립할 때 물 흐름 튜브가 구부러지거나 교차되지 않도록 해야 합니다. 튜브가 구부러지거나 교차하면 물의 적절한 흐름을 방해하고 냉각 효율이 감소할 수 있습니다. 튜브 연결은 적절하게 맞고 조여져야 합니다. 필요한 경우 기밀성을 보장하기 위해 직경이 다른 부드러운 튜브를 대신 사용할 수 있습니다. 연결이 충분히 빡빡하지 않더라도 페이스트는 나중에 사용하는 동안 막힐 수 있으므로 적용해서는 안 됩니다. 실내 습도는 냉각 성능에 영향을 미치고 냉각 단계에 응결과 얼음을 유발합니다. 냉각 단계에 재배 판을 놓기 전에 종이 티슈를 사용하여 결로를 제거하거나 방열판을 사용하여 사파이어 창에 형성된 얼음을 빠르게 제거하는 것이 좋습니다. 펌프 탱크와 라디에이터 팬은 동일한 테이블에서 작동하는 경우 현미경에 작은 진동을 일으킬 수 있습니다. 현미경 진동은 획득한 이미지를 흐리게 하므로 피해야 합니다. 쿠션을 사용하여 탱크와 라디에이터를 기계적으로 단열하거나 별도의 근처 테이블에 놓을 수 있습니다. 냉각 stage는 가열 stage가 될 수 있습니다.tage 펠티에에 대한 전기 연결을 반대로 합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 동판 가공에 대해 Noah Joseph (Northeastern Bioengineering Department)에게 감사드립니다.
12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |