우리는 프로테옴 규모에서 단백질 발견 및 정량화와 호환되는 고품질 미토콘드리아 분리를 위한 2단계 프로토콜을 제시합니다. 우리의 프로토콜은 유전 공학을 필요로하지 않으므로 모든 일차 세포와 조직에서 미토콘드리아를 연구하는 데 적합합니다.
중추 대사에서 신경 퇴행에 대한 면역 반응에 이르기까지 대부분의 생리 및 질병 과정에는 미토콘드리아가 포함됩니다. 미토콘드리아 프로테옴은 1,000개 이상의 단백질로 구성되어 있으며, 각각의 풍부함은 외부 자극에 반응하거나 질병 진행 중에 동적으로 변할 수 있습니다. 여기에서는 일차 세포와 조직에서 고품질 미토콘드리아를 분리하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 2단계 절차는 (1) 미토콘드리아를 분리하기 위한 기계적 균질화 및 차등 원심분리, (2) 순수한 세포 소기관을 분리하고 오염 물질을 제거하기 위한 태그 없는 미토콘드리아의 면역 포획으로 구성됩니다. 각 정제 단계의 미토콘드리아 단백질은 정량적 질량 분석법으로 분석되고 농축 수율이 계산되어 감산 단백질체학에 의한 새로운 미토콘드리아 단백질의 발견이 가능합니다. 당사의 프로토콜은 세포주, 일차 세포 및 조직의 미토콘드리아 함량을 연구하기 위한 민감하고 포괄적인 접근 방식을 제공합니다.
미토콘드리아는 세포의 대사 요구를 감지하고 적응할 수 있는 복잡하고 역동적인 세포 기관입니다. 세포 대사의 복잡성의 중심인 미토콘드리아는 탄수화물, 단백질, 지질, 핵산 및 보조 인자 대사 반응이 수렴하는 대사 허브 역할을 합니다1. 그들은 또한 선천성 면역 반응의 경로와 이온 및 활성 산소 종의 변화에 대한 반응에 대한 신호 소기관 역할을 합니다 2,3. 현재까지 약 1,100개의 단백질이 미토콘드리아 4,5,6에 매핑되었지만, 특히 특정 세포 유형에서만 또는 특정 환경 조건에서 일시적으로 발현되는 단백질은 더 많이 발견되어야 한다고 가정할 수 있습니다. 관심 대사 상태에서 미토콘드리아 구성의 변화를 정량화하기 위한 새로운 접근법을 개발하면 이러한 세포 소기관에 대한 지식이 증가하고 미토콘드리아 기능 장애를 특징으로 하는 장애에 대한 새로운 치료 방법이 강조될 것입니다7.
현재, 다양한 미토콘드리아 분리 프로토콜을 사용할 수 있으며, 수율과 순도 수준이 다르다8. 원심분리 기반 접근 방식은 단순성과 저렴한 비용으로 인해 가장 널리 사용됩니다. 대부분의 응용 분야에 적합하지만, 차등 원심분리는 더 낮은 미토콘드리아 순도를 얻고 더 복잡한 밀도 구배 기반 응용 프로그램이 사용될 때 많은 양의 출발 물질을 필요로 하는 단점이 있습니다. 최근 몇 년 동안, 태그 기반 면역 포획(“MITO-IP”)9 및 형광 활성화 세포 소기관 분류10와 같은 미토콘드리아 분리를 위한 새로운 방법이 등장했습니다. 두 절차 모두 고순도 샘플을 생성할 수 있지만, 전자는 친화성 정제를 위해 미토콘드리아에 태그를 지정하기 위해 유전 공학이 필요하므로 프로토콜이 변형되지 않은 유기체 또는 인간 기증자의 1차 물질과 양립할 수 없습니다. 한편, 후자는 유세포 분석 및 분류 장비에 대한 접근에 의존합니다. 다양한 분리 방법을 결합하면 보다 강력한 프로토콜을 생성하고 순도를 높일 수 있습니다.
여기에서 우리는 (1) 미토콘드리아 분획을 분리하기 위한 차등 원심분리와 (2) 유비쿼터스 미토콘드리아 외막 단백질인 외부 미토콘드리아 막 22(Tomm22)11의 트랜스로카제에 대한 항체에 공유 결합된 초상자성 비드를 사용한 미토콘드리아의 태그 없는 면역 포획이라는 두 가지 기존 방법의 조합을 기반으로 하는 미토콘드리아 분리를 위한 새로운 프로토콜을 제시합니다(그림 1). 우리가 설명하는 절차는 정량적 단백질 질량 분석법과 호환되며 태그가 없고 유전자 조작이 필요하지 않기 때문에 세포주에서 체액, 전체 동물 조직에 이르기까지 광범위한 연구 모델에 적용할 수 있습니다. 또한, 프로토콜에서 두 단계를 사용하면 새로운 미토콘드리아 단백질의 발견 및 발현 연구를 위해 감산 단백질체학 6,12을 사용할 수 있습니다.
우리는 미토콘드리아 분리를 위한 향상된 순도를 달성하기 위해 차등 원심분리와 면역포획을 결합했습니다. 우리의 절차는 새로운 미토콘드리아 단백질의 식별 및 특성화를 위한 1차 물질에 대한 접근을 허용합니다. 이 프로토콜은 간단하고 강력하며 유전자 변형 없이 세포주, 일차 세포 및 조직에 적용할 수 있습니다. 우리는 정제 절차 전반에 걸쳐 여러 단계에서 채취한 샘플에 대한 면역블로팅 및 단백질체학 분석을 통해 프로토콜을 검증했습니다.
단일 분리 방법과 비교하여 다양한 특성의 농축 단계(여기서는 원심분리 및 면역 표지)의 조합은 미토콘드리아를 분리하기 위한 보다 강력한 프로토콜을 생성합니다. 이는 미토콘드리아 단백질이 두 정제 모두에서 농축되지만 두 농축 단계 후에도 오염 물질도 농축될 가능성이 낮기 때문입니다. 높은 미토콘드리아 순도는 밀도 구배 초원심분리에 의해서도 달성될 수 있지만, 이 접근법은 많은 양의 출발 물질과 초원심분리기에 대한 접근을 필요로 한다. 마지막으로, 태그 기반 미토콘드리아 분리(mitochondrial isolation)20를 기반으로 하는 최근의 방법과는 대조적으로, 우리의 접근법은 샘플의 유전자 변형을 필요로 하지 않기 때문에, 모든 출처의 1차 물질에 적합하다.
프로토콜을 적용할 때 실험 설계에서 몇 가지 기술적 및 생물학적 고려 사항을 고려해야 합니다. (1) 충분한 물질을 얻기 위해서는 출발 물질의 양이 중요합니다. 필연적으로, 소수의 미토콘드리아는 균질화 (단계 3.10) 동안, 모든 세포가 용해되지 않기 때문에, 또는 3 개의 컬럼 세척 (단계 4.6) 동안 손실 될 것이다. 우리의 프로토콜은 수율보다 순도에 초점을 맞추고 있지만, 미토콘드리아 분리의 효율성과 그에 따른 수율은 측정되거나 최적화되지 않았습니다. 더 많은 Tomm22 비드와 더 많은 컬럼을 사용하면 미토콘드리아 회수율이 증가할 것으로 예상됩니다. 동시에, 균질화 단계의 철저한 최적화는 또한 미토콘드리아 수율 향상으로 이어질 수 있다. 이 프로토콜과 RAW264.7 세포 및 BMDM에 대해 여기에서 보고하는 초기 세포 번호는 단백질체학에 적합하며 다른 응용 분야에 맞게 조정할 수 있습니다. 1차 BMDM의 경우 단일 마우스가 한 번의 반복에 충분하다는 것을 발견했습니다. 필요한 경우 절차를 확장하여 여러 동물에서 BMDM을 분리한 다음 풀링하여 충분한 재료를 얻을 수 있습니다. 세포 수는 세포 유형, 크기 및 미토콘드리아 함량에 따라 최적화될 수 있습니다. (2) Tomm22는 모든 세포 유형 및 조직의 미토콘드리아에서 발현됩니다.21, 그러나 그 발현 수준은 다를 수 있습니다. 따라서 서로 다른 조건을 비교하기 위해 실험을 설계할 때 Tomm22의 발현 수준이 비교 가능한지 확인하는 것이 중요합니다. 또한, Tomm22의 유비쿼터스 발현으로 인해 복잡한 조직 내에서 세포 유형 특이적 미토콘드리아 단백질을 연구하는 것은 불가능합니다. (3) 순수한 미토콘드리아를 생성하는 데 필요한 시간(약 2.5시간)은 대사 프로필의 변화와 같은 일시적인 사건에 대한 연구와 양립할 수 없습니다. 이 경우 직접 태그 기반 면역 캡처를 권장합니다9, 또한 세포 유형 특정 미토콘드리아를 연구 할 수 있습니다 in vivo20. (4) Tomm22 항체 표지 비드 단독을 사용하여 얻은 분리된 미토콘드리아에 대한 연구는 기능 분석에서 활성을 나타냈지만11, 우리의 프로토콜로 생성된 미토콘드리아가 다운스트림 활성 기반 분석과 호환되는지 여부는 아직 결정되지 않았습니다. MitoTracker 또는 테트라메틸로다민 메틸 에스테르 과염소산염(TMRM) 염색 또는 호흡 측정 측정은 분리된 미토콘드리아의 기능을 정량화하는 잠재적인 접근 방식입니다22. (5) 컬럼에서 “미토-순수” 샘플을 용리한 후 일부 Tomm22 비드가 순수 미토콘드리아 분획(그림 2B). 트립신 분해 및 단백질 질량 분석에 간섭이 관찰되지 않았지만 이러한 비드와 면역글로불린의 존재는 다른 다운스트림 응용 분야에서 고려되어야 합니다. Tomm22 항체는 마우스에서 생산되는 단클론 항체입니다23따라서 면역 블로팅에서 마우스에 대한 2 차 항체를 사용할 때 면역 글로불린 사슬의 크기에서 비특이적 인 밴드를 생성한다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. (6) 세포 현탁액의 완전한 균질화는 미토콘드리아의 성공적인 분리의 핵심입니다. 여기서는 25G 바늘이 있는 주사기를 사용하여 RAW264.7 세포와 BMDM을 모두 용해합니다. 그러나 세포 유형 및 크기에 따라 Dounce 균질화기 사용과 같은 다른 기계적 균질화 방법 또는 세포 균질화 장치와 같은 보다 제어된 접근 방식이 더 적합할 수 있습니다. 부드러운 초음파 처리와 같은 비 기계적 균질화 방법도 고려할 수 있습니다. 조직 균질화 접근법은 다른 연구에서 추가로 논의됩니다24,25. (7) 면역 블로팅에 의한 검증이 가장 간단하고 저렴한 방법이지만 그 결과가 전체 세포 기관 수준의 변화와 항상 상관관계가 있는 것은 아닙니다. 그렇기 때문에 미토콘드리아와 다른 세포 기관의 농축 또는 고갈을 완전히 검증하기 위해 단백질체학을 사용하는 것이 좋습니다.
여기에 설명된 2단계 미토콘드리아 정제 프로토콜은 미토콘드리아 순도가 증가하는 순차적인 샘플을 생성할 수 있게 해주며, 이를 통해 감산 단백질체학(subtractactive proteomics)을 통해 새로운 미토콘드리아 단백질 후보를 발견할 수 있게 해주었다12. 분석을 위해 엄격한 임계값을 사용하여 상당히 풍부한 미토콘드리아 단백질을 선택하며, 이로 인해 알려진 일부 미토콘드리아 단백질을 식별하지 못할 수 있지만(그림 3A) 새로운 미토콘드리아 단백질 발견에 대한 위양성 비율은 감소합니다. 그럼에도 불구하고, 우리의 프로토콜에 의해 밝혀진 모든 후보 단백질은 직교 접근법을 통해 검증되어야한다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 미토콘드리아와의 연관성을 현미경으로 또는 프로테아제 보호 분석으로 검증하기 위해 카르복시 말단 GFP-태깅 또는 내인성 단백질에 대한 항체 사용을 권장합니다.
변형되지 않은 세포와 조직의 경우 우리 방법을 직접 적용하면 미토콘드리아가 건강 및 질병 조건에서 환경에 어떻게 변화하고 적응하는지 조사할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다. 세포주, 동물 질병 모델, 인체 체액, 심지어 수술 생검에 대한 우리의 프로토콜을 적용하는 것은 미토콘드리아 및 관련 장애에 대한 이해를 높이는 데 특히 유용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
도움을 주신 Manfredo Quadroni, 단백질 분석 시설 및 로잔 대학의 전자 현미경 시설에 감사드립니다. 또한 원고에 대한 조언과 피드백을 주신 H.G. Sprenger, K. Maundrell, Jourdain 연구소 구성원들에게도 감사드립니다. 이 작업은 Pierre-Mercier pour la Science 재단과 스위스 국립 과학 재단 (프로젝트 보조금 310030_200796)의 지원을 받았습니다.
1 mL syringe | BD Plastipal | 309628 | |
25 G Needle | BD Microlance | 300400 | |
40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
Anti-TOM22 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-127-693 | |
Cell scraper | FisherScientific | 11577692 | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX | ThermoFisher | 31966 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | FisherScientific | BP-120-1 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | |
HEPES | BioConcept | 5-31F00-H | |
LS columns and plungers | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Macrophage colony-stimulating factor | Immunotools | 12343115 | |
Mannitol | Sigma | M4125 | |
Sodium chloride | Sigma | 71380 | |
Sucrose | Sigma | S1888 | |
Penicillin/Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
Petri dishes | Corning | BH93B-102 | |
Phosphate-buffered saline 10X | Eurobio Scientific | CS3PBS01-01 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | C19196 |