הפרוטוקול הנוכחי מכין ומעריך את התכונות הפיזיקליות, התגובה החיסונית וההשפעה המגנה in vivo של חיסון אדג’ובנטי ננו-תחליב חדשני.
חיסונים אדג’ובנטיים של ננו-תחליב משכו תשומת לב נרחבת בגלל גודל החלקיקים הקטן שלהם, יציבות תרמית גבוהה ויכולתם לגרום לתגובות חיסוניות תקפות. עם זאת, קביעת סדרה של פרוטוקולים מקיפים להערכת התגובה החיסונית של חיסון אדג’ובנטי ננו-תחליב חדשני היא חיונית. לכן, מאמר זה כולל הליך קפדני לקביעת המאפיינים הפיזיקוכימיים של חיסון (על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור [TEM], מיקרוסקופ כוח אטומי [AFM], ופיזור אור דינמי [DLS]), יציבות האנטיגן והמערכת של החיסון (על ידי בדיקת צנטריפוגה במהירות גבוהה, בדיקת יציבות תרמודינמית, SDS-PAGE וכתם מערבי), והתגובה החיסונית הספציפית (IgG1, IgG2a, ו- IgG2b). באמצעות גישה זו, חוקרים יכולים להעריך במדויק את ההשפעה המגנה של חיסון אדג’ובנטי ננו-תחליב חדשני במודל קטלני של עכבר MRSA252. בעזרת פרוטוקולים אלה, ניתן לזהות את האדג’ובנט המבטיח ביותר של חיסון ננו-תחליב במונחים של פוטנציאל אדג’ובנטי יעיל. בנוסף, השיטות יכולות לסייע באופטימיזציה של חיסונים חדשים לפיתוח עתידי.
סטפילוקוקוס זהוב עמיד למתיצילין (MRSA) הוא פתוגן אופורטוניסטי עם אחד משיעורי הזיהום הגבוהים ביותר ביחידה לטיפול נמרץ (ICU) מחלקות1, מחלקות קרדיולוגיה ומחלקות כוויות ברחבי העולם. MRSA מציג שיעורים גבוהים של זיהום, תמותה ועמידות רחבה לתרופות, מה שמציג קשיים גדולים בטיפול קליני2. ברשימת העדיפות העולמית של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה שפורסמה על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) בשנת 2017, MRSA היה רשום בקטגוריה3 הקריטית ביותר. לכן יש צורך דחוף בחיסון נגד זיהום MRSA.
אדג’ובנט אלומיניום נמצא בשימוש מזה זמן רב, ומנגנון העזר האדג’ובנטי ברור יחסית, בטוח, יעיל ונסבל היטב4. אדג’ובנטים מאלומיניום הם כיום סוג נפוץ של אדג’ובנט. מקובל לחשוב כי אנטיגנים הנספחים על חלקיקי מלח אלומיניום יכולים לשפר את היציבות ולשפר את היכולת של אתר ההזרקה לספוג אנטיגנים, לספק ספיגה טובה ושחרור איטי5. נכון לעכשיו, החיסרון העיקרי של אדג’ובנטים מאלומיניום הוא שהם חסרים אפקט אדג’ובנטי או מציגים רק השפעה אדג’ובנטית חלשה על חלק מהאנטיגנים המועמדים לחיסון6. בנוסף, אדג’ובנטים מאלומיניום גורמים לתגובות רגישות יתר בתיווך IgE5. לכן, יש צורך לפתח אדג’ובנטים חדשים כדי לעורר תגובה חיסונית חזקה יותר.
אדג’ובנטים של ננו-תחליב הם מערכות פיזור קולואידיות המורכבות מנפט, מים, חומרים פעילי שטח וקוסורפקטנטים7. בנוסף, האדג’ובנטים יציבים מבחינה תרמודינמית ואיזוטרופיים, ניתנים לאוטוקלאבינג או לייצוב על ידי צנטריפוגה במהירות גבוהה, ויכולים להיווצר באופן ספונטני בתנאי הכנה מתונים. מספר אדג’ובנטים של תחליב (כגון MF59, סדרת NB001-002, סדרת AS01-04 וכו ‘) נמצאים כיום בשוק או בשלב המחקר הקליני, אך גודל החלקיקים שלהם גדול מ -160 ננומטר8. לכן, היתרונות של תכשירים רפואיים ננומטריים (1-100 ננומטר) (כלומר, שטח פנים ספציפי גדול, גודל חלקיקים קטנים, אפקט פני שטח, אנרגיית שטח גבוהה, אפקט גודל קטן ואפקט מנהור קוונטי מאקרו) אינם ניתנים לניצול מלא. בפרוטוקול הנוכחי, אדג’ובנט חדשני המבוסס על טכנולוגיית ננו-תחליב בקוטר של 1-100 ננומטר דווח כבעל פעילות אדג’ובנטית טובה9. בדקנו את חלבון האנטיגן של החיסון מסוג רקומבינציה HI (מוטנט α-המוליזין [Hla] ומשטח יון Fe הקובע גורם B [IsdB] תת-יחידה N2 חלבון היתוך מקטע פעיל); סדרה של נהלים נקבעו כדי לבחון את התכונות הפיזיות והיציבות, להעריך את תגובת הנוגדנים הספציפית שלו לאחר מתן תוך שרירי, ולבחון את ההשפעה המגנה של החיסון באמצעות מודל זיהום מערכתי בעכבר.
IsdB, חלבון פני השטח מעוגן דופן תא חיידקי ומווסת ברזל, ממלא תפקיד חשוב בתהליך קבלת ברזל הם15. HLA, רעלן אלפא, הוא בין הרעלנים החיידקיים היעילים ביותר הידועים ב- MRSA, והוא יכול ליצור נקבוביות בתאים איקריוטים ולהפריע להידבקות ולתאי אפיתל16. במחקר שלנו, חלבון אנטיג…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי מס ‘2021YFC2302603 של תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין, מס ‘32070924 ו -32000651 של NSFC, ומס ‘2019jcyjA-msxmx0159 של תוכנית פרויקט הקרן למדעי הטבע של צ’ונגצ’ינג.
5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
Gel image | Tanon, USA | null | |
Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
MRSA252 | USA, ATCC | null | |
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
PBS | biosharp, China | null | |
PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |