Summary

Bir nanoemülsiyon adjuvan aşısının metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) Enfeksiyonuna Karşı İmmün Yanıtının Değerlendirilmesi

Published: September 01, 2023
doi:

Summary

Bu protokol, yeni bir nanoemülsiyon adjuvan aşısının fiziksel özelliklerini, immün yanıtını ve in vivo koruyucu etkisini hazırlar ve değerlendirir.

Abstract

Nanoemülsiyon adjuvan aşıları, küçük partikül boyutları, yüksek termal stabiliteleri ve geçerli bağışıklık tepkilerini indükleme yetenekleri nedeniyle büyük ilgi görmüştür. Bununla birlikte, yeni bir nanoemülsiyon adjuvan aşısının bağışıklık tepkisini değerlendirmek için bir dizi kapsamlı protokol oluşturmak hayati önem taşımaktadır. Bu nedenle, bu makale bir aşının fizikokimyasal özelliklerini (iletim elektron mikroskobu [TEM], atomik kuvvet mikroskobu [AFM] ve dinamik ışık saçılması [DLS]), aşı antijeninin ve sisteminin stabilitesini (yüksek hızlı santrifüj testi, termodinamik stabilite testi, SDS-PAGE ve batı lekesi ile) ve spesifik bağışıklık tepkisini (IgG1, IgG2a ve IgG2b). Bu yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar ölümcül bir MRSA252 fare modelinde yeni bir nanoemülsiyon adjuvan aşısının koruyucu etkisini doğru bir şekilde değerlendirebilirler. Bu protokollerle, etkili adjuvan potansiyeli açısından en umut verici nanoemülsiyon aşısı adjuvanı belirlenebilir. Ek olarak, yöntemler gelecekteki gelişmeler için yeni aşıların optimize edilmesine yardımcı olabilir.

Introduction

Metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA), yoğun bakım ünitesi (YBÜ) koğuş1, kardiyoloji bölümleri ve yanık bölümlerinde dünya çapında en yüksek enfeksiyon oranlarından birine sahip fırsatçı bir patojendir. MRSA, yüksek enfeksiyon, mortalite oranları ve geniş ilaç direnci göstermekte ve klinik tedavide büyük zorluklar ortaya koymaktadır2. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından 2017 yılında yayınlanan Antibiyotiğe Dirençli Bakterilerin Küresel Öncelik Listesi’nde MRSA, en kritik kategori3’te yer aldı. Bu nedenle MRSA enfeksiyonuna karşı bir aşıya acilen ihtiyaç vardır.

Alüminyum adjuvan uzun süredir kullanılmaktadır ve adjuvan yardımcı mekanizma nispeten açık, güvenli, etkili ve iyi tolere edilir4. Alüminyum adjuvanlar şu anda yaygın olarak kullanılan bir adjuvan türüdür. Genel olarak, alüminyum tuzu parçacıkları üzerinde adsorbe edilen antijenlerin stabiliteyi artırabileceğine ve enjeksiyon bölgesinin antijenleri alma yeteneğini artırabileceğine, iyi emilim ve yavaş salınım sağlayabileceğine inanılmaktadır5. Şu anda, alüminyum adjuvanların ana dezavantajı, adjuvan bir etkiye sahip olmamaları veya bazı aşı adayıantijenler 6 üzerinde sadece zayıf bir adjuvan etki göstermeleridir. Ek olarak, alüminyum adjuvanlar IgE aracılı aşırı duyarlılık reaksiyonlarını indükler5. Bu nedenle, daha güçlü bir bağışıklık tepkisini uyarmak için yeni adjuvanlar geliştirmek gerekir.

Nanoemülsiyon adjuvanları, yağ, su, yüzey aktif maddeler ve kosürfaktan oluşan kolloidal dispersiyon sistemleridir7. Ek olarak, adjuvanlar termodinamik olarak stabil ve izotropiktir, yüksek hızlı santrifüjleme ile otoklavlanabilir veya stabilize edilebilir ve hafif hazırlık koşulları altında kendiliğinden oluşturulabilir. Birkaç emülsiyon adjuvanı (MF59, NB001-002 serisi, AS01-04 serisi, vb. gibi) şu anda piyasada veya klinik araştırma aşamasındadır, ancak partikül boyutları 160 nm8’den büyüktür. Bu nedenle, nano ölçekli (1-100 nm) tıbbi preparatların avantajları (yani, büyük spesifik yüzey alanı, küçük parçacık boyutu, yüzey etkisi, yüksek yüzey enerjisi, küçük boyut etkisi ve makro kuantum tünelleme etkisi) tam olarak kullanılamaz. Bu protokolde, 1-100 nm çap büyüklüğünde nanoemülsiyon teknolojisine dayanan yeni bir adjuvanın iyi bir adjuvan aktivitesi sergilediği bildirilmiştir9. Rekombinasyon alt birim aşı antijen proteini HI (α-hemolizin mutantı [Hla] ve Fe iyon yüzeyini belirleyen faktör B [IsdB] alt birimi N2 aktif fragman füzyon proteini) test ettik; Fiziksel özellikleri ve stabiliteyi incelemek, intramüsküler uygulamadan sonra spesifik antikor yanıtını değerlendirmek ve bir fare sistemik enfeksiyon modeli kullanarak aşının koruyucu etkisini test etmek için bir dizi prosedür oluşturulmuştur.

Protocol

Hayvan deneyleri, deney hayvanlarının kullanımı ve bakımı ile ilgili el kitabına dayanarak yürütülmüş ve Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Refahı ve Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada 6-8 haftalık dişi Balb/c fareleri kullanıldı. Hayvanlar ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). 1. MRSA HI antijen proteininin hazırlanması IsdB ve Hla klonlarını t…

Representative Results

Nanoemülsiyon adjuvan aşısının hazırlanmasına yönelik protokol ve bu aşının in vitro ve in vivo testleri değerlendirildi. Bu numunenin yüzeyindeki zeta potansiyelinin ve partikül boyutunun önemli özelliklerini belirlemek için TEM, AFM ve DLS kullanılmıştır (Şekil 1). SDS-PAGE ve western blotting, çökelti ve süpernatanttaki antijen miktarının santrifüjlemeden sonra önemli ölçüde bozulmadığını gösterdi, bu da aşının yapısal olarak sağ…

Discussion

Bakteriyel hücre duvarına bağlı ve demir regüle edilmiş bir yüzey proteini olan IsdB, heme demir15’in elde edilmesi sürecinde önemli bir rol oynar. Hla, alfa toksini, MRSA’da bilinen en etkili bakteriyel toksinler arasındadır ve ökaryotik hücrelerde gözenekler oluşturabilir ve yapışma ve epitel hücrelerine müdahale edebilir16. Çalışmamızda, IsdB ve Hla’nın antijen genlerine dayanan gen mühendisliği teknolojisi il…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı’nın No. 2021YFC2302603, NSFC’nin No. 32070924 ve 32000651 ve Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı Proje Programı’nın No. 2019jcyjA-msxmx0159 tarafından desteklenmiştir.

Materials

5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 Eppendorf, Germany  5424000495
96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
AFM Dimension FastScan BRUKER, Germany  null
Alcohol lamp Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China YBS-AA-11408
Balb/c mice  Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. 
BCIP/NBT Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA null
BL21 Competent Cell Merck millipore,Germany 70232-3CN
BSA-100G Sigma-Aldrich, USA B2064-100G
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
Coomassie bright blue G-250 staining solution MIKX,China DB236
Decolorization solution BOSTER,China AR0163-2
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China null
Electrophoresis apparatus Beijing Liuyi Instrument Factory, China DYCZ-25D
Gel image Tanon, USA null
Glutathione-Sepharose Resin GST Mei5bio,China affinity chromatography resin
H2SO4 Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China 7664-93-9
HI recombinant protein Third Military Medical University,China 110-27-0
HRP -Goat Anti-Mouse IgG Biodragon, China BF03001
HRP- Goat anti-mouse IgG1 Biodragon, China BF03002R
HRP- Goat anti-mouse IgG2a Biodragon, China BF03003R
HRP- Goat anti-mouse IgG2b Biodragon, China BF03004R
Inoculation loop Haimen Feiyue Co.,LTD,China YR-JZH-1UL
IsdB and Hla clones Shanghai Jereh Biotechnology Co,China null
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) SEPPIC, France null
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside fdbio,China FD3278-1
LB bouillon culture-medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-136
Lnfrared physiotherapy lamp Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China 7600
Low temperature refrigerated centrifuge Eppendorf, Germany  null
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK null
MH(A) medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-051
MH(B) medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-052
Micro plate washing machine 405 LSRS Bio Tek Instruments,Inc Highland  Park,USA null
Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China 1658030
MMC packing TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD 0022818
MRSA252 USA, ATCC null
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo Scientific, USA null
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit DAKEWE, China 8012011
PBS biosharp, China null
PCR, Amplifier Thermal Cycler, USA null
pGEX-target gene recombinant plasmid Shanghai Jereh Biotechnology Co,China B3528G
Phosphotungstic acid G-CLONE, China CS1231-25g
pipette Eppendorf, Germany  3120000844
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) Aladdin, China K400327-1kg
Primary antibody Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera null See Reference 11 for details
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) Sigma-Aldrich, USA P4347-500ML
Protein Marker Thermo Scientufuc, USA 26616
PVDF TRANSFER MEMBRANE Invitrogen,USA 88518
Scanning Electron Microscope JEOL,Japan JSM-IT800
Sodium pentobarbital Merck,Germany Tc-P8411
Talos L120C TEM Thermo Fisher, USA null
TMB color solution TIAN GEN, China PA107-01
Turtle kits Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD ES80545
Tween-20 Macklin, China 9005-64-5

Referenzen

  1. Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
  2. Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
  3. Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
  4. Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
  5. Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
  6. Geoghegan, S., O’Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
  7. Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
  8. Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
  9. Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
  10. Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
  11. Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  12. National Pharmacopoeia Committee. . Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).
  13. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
  14. Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
  15. Roy, U., Kornitzer, D. Heme-iron acquisition in fungi. Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).
  16. Saeed, K., et al. Bacterial toxins in musculoskeletal infections. Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).
  17. Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
  18. Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
  19. Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
  20. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  21. Francis, M. J. Recent advances in vaccine technologies. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).
  22. Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
  23. Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
  24. Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molekularbiologie. 53 (5), 799-814 (2019).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Zeng, X., Sun, H., Ye, Y., Luo, X., Cai, D., Yang, Y., Chen, T., Sun, C., Zhang, S., Zeng, H. Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection. J. Vis. Exp. (199), e65152, doi:10.3791/65152 (2023).

View Video