Summary

Formulierung und Charakterisierung bioaktiver Wirkstoffe, die Nanoscheiben enthalten

Published: March 17, 2023
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Summary

Hier beschreiben wir die Herstellung und Charakterisierung von bioaktiven Wirkstoffen, die Nanoscheiben enthalten. Amphotericin-B-Nanoscheiben werden als Beispiel genommen, um das Protokoll schrittweise zu beschreiben.

Abstract

Der Begriff Nanodisk bezieht sich auf eine diskrete Art von Nanopartikeln, die aus einer Doppelschicht, die ein Lipid bildet, einem Gerüstprotein und einem integrierten bioaktiven Wirkstoff besteht. Nanoscheiben sind als scheibenförmige Lipiddoppelschicht organisiert, deren Umfang durch das Gerüstprotein begrenzt wird, das normalerweise zur Familie der austauschbaren Apolipoproteine gehört. Zahlreiche hydrophobe bioaktive Wirkstoffe wurden in Nanoscheiben effizient gelöst, indem sie in das hydrophobe Milieu der Lipiddoppelschicht des Partikels integriert wurden, was zu einer weitgehend homogenen Population von Partikeln im Bereich von 10-20 nm Durchmesser führte. Die Formulierung von Nanoscheiben erfordert ein präzises Verhältnis der einzelnen Komponenten, eine geeignete sequenzielle Zugabe jeder Komponente, gefolgt von einer Badbeschallung der Formulierungsmischung. Das amphipathische Gerüstprotein kontaktiert und reorganisiert spontan die dispergierte Doppelschicht, die ein Lipid/bioaktives Wirkstoffgemisch bildet, um eine diskrete, homogene Population von Nanoscheibenpartikeln zu bilden. Während dieses Prozesses geht das Reaktionsgemisch von einem undurchsichtigen, trüben Aussehen in eine geklärte Probe über, die, wenn sie vollständig optimiert ist, beim Zentrifugieren keinen Niederschlag ergibt. Die Charakterisierungsstudien umfassen die Bestimmung der Solubilisierungseffizienz bioaktiver Wirkstoffe, Elektronenmikroskopie, Gelfiltrationschromatographie, UV/Vis-Absorptionsspektroskopie und/oder Fluoreszenzspektroskopie. Daran schließt sich in der Regel eine Untersuchung der biologischen Aktivität mit kultivierten Zellen oder Mäusen an. Im Falle von Nanodisks, die ein Antibiotikum (d. h. das Makrolid-Polyen-Antibiotikum Amphotericin B) enthalten, kann ihre Fähigkeit, das Wachstum von Hefen oder Pilzen in Abhängigkeit von Konzentration oder Zeit zu hemmen, gemessen werden. Die relativ einfache Formulierung, die Vielseitigkeit in Bezug auf die Komponenten, die nanoskalige Partikelgröße, die inhärente Stabilität und die wässrige Löslichkeit ermöglichen unzählige In-vitro – und In-vivo-Anwendungen der Nanodisk-Technologie . Im vorliegenden Artikel beschreiben wir eine allgemeine Methodik zur Formulierung und Charakterisierung von Nanodisks, die Amphotericin B als hydrophoben bioaktiven Wirkstoff enthalten.

Introduction

Entstehende diskoidale High-Density-Lipoproteine (HDLs) sind natürlich vorkommende Vorläufer des weitaus häufiger vorkommenden sphärischen HDL, das im menschlichen Kreislaufsystem vorkommt. Diese entstehenden Partikel, die auch als prä-ß-HDL bezeichnet werden, besitzen einzigartige und unverwechselbare strukturelle Eigenschaften1. Tatsächlich existieren die entstehenden HDLs nicht als kugelförmige Partikel, sondern sind scheibenförmig. Umfangreiche strukturelle Charakterisierungsstudien an natürlichen und rekonstituierten diskoidalen HDLs haben gezeigt, dass sie aus einer Phospholipiddoppelschicht bestehen, deren Umfang durch ein amphipathisches austauschbares Apolipoprotein (apo), wie z.B. apoA-I, begrenzt ist. Im humanen Lipoproteinstoffwechsel akkumulieren zirkulierende naszierende HDLs Lipide aus peripheren Zellen und reifen zu kugelförmigen HDLs in einem Prozess, der von wichtigen Proteinmediatoren abhängig ist, darunter der ATP-bindende Kassettentransporter A1 und Lecithin:Cholesterin-Acyltransfers2. Dieser Prozess stellt eine wichtige Komponente des umgekehrten Cholesterintransportwegs dar, der als Schutz vor Herzerkrankungen gilt. Ausgestattet mit diesem Wissen und der Fähigkeit, diskoidale HDLs zu rekonstruieren, haben Forscher diese Partikel als therapeutische Intervention zur Behandlung von Atheroskleroseeingesetzt 3. Im Wesentlichen fördert die Infusion von rekonstituiertem HDL (rHDL) in Patienten den Cholesterinausfluss aus Plaqueablagerungen und gibt es zur Leber zurück, wo es in Gallensäuren umgewandelt und aus dem Körper ausgeschieden wird. Mehrere Biotechnologie-/Pharmaunternehmen verfolgen diese Behandlungsstrategie4.

Gleichzeitig hat die Möglichkeit, diese Partikel im Labor zu erzeugen, eine Flut von Forschungsaktivitäten ausgelöst, die zu neuartigen Anwendungen und neuen Technologien geführt haben. Eine prominente Anwendung ist die Verwendung von rHDL-Partikeln als Miniaturmembran zur Unterbringung von Transmembranproteinen in einer nativen Umgebung5. Bis heute wurden Hunderte von Proteinen erfolgreich in diskoidales rHDL eingebaut, und die Forschung hat gezeigt, dass diese Proteine sowohl die native Konformation als auch die biologische Aktivität als Rezeptoren, Enzyme, Transporter usw. beibehalten. Es hat sich auch gezeigt, dass diese Partikel, die als “Nanodiscs” bezeichnet werden, für eine strukturelle Charakterisierung geeignet sind, oft mit hoher Auflösung6. Dieser Ansatz zur Untersuchung von Transmembranproteinen gilt als überlegen gegenüber Studien mit Detergenzienmizellen oder Liposomen und schreitet daher rasch voran. Es ist wichtig zu erkennen, dass zwei verschiedene Methoden beschrieben wurden, die in der Lage sind, eine rHDL zu bilden. Die “Cholatdialyse”-Methode13 ist beliebt für Anwendungen, die mit dem Einbau von Transmembranproteinen in die rHDL-Doppelschicht5 zusammenhängen. Im Wesentlichen beinhaltet dieses Formulierungsverfahren das Mischen einer Doppelschicht, die ein Phospholipid, ein Gerüstprotein bildet, und das interessierende Transmembranprotein in einem Puffer, der das Detergens Natriumcholat (oder Natriumdesoxycholat; Mizellenmolekulargewicht [MW] von 4.200 Da) enthält. Das Detergens löst die verschiedenen Reaktionskomponenten effektiv auf, so dass die Probe gegen Puffer ohne Detergens dialysiert werden kann. Während des Dialyseschritts, wenn das Detergen aus der Probe entfernt wird, bildet sich spontan ein rHDL. Wenn dieser Ansatz verwendet wird, um ein Transmembranprotein von Interesse einzufangen, wurden die Produktpartikel als Nanoscheiben5 bezeichnet. Versuche, mit dieser Methode niedermolekulare hydrophobe bioaktive Wirkstoffe (MW <1.000 Da) einzubauen, blieben jedoch weitgehend erfolglos. Im Gegensatz zu Transmembranproteinen sind niedermolekulare bioaktive Wirkstoffe in der Lage, zusammen mit dem Detergens aus dem Dialysebeutel zu entweichen, was ihre Inkorporationseffizienz in rHDLs stark verringert. Dieses Problem wurde gelöst, indem Detergenzien aus der Formulierungsmischung14 weggelassen wurden. Stattdessen werden die Komponenten nacheinander in einen wässrigen Puffer gegeben, beginnend mit der Doppelschicht, die ein Lipid bildet, wodurch ein stabiler bioaktiver Wirkstoff entsteht, der rHDL enthält, der als Nanodisk bezeichnet wird. Andere haben rHDL für den Einbau und Transport von In-vivo-Bildgebungsmitteln verwendet 7. In jüngerer Zeit wurden spezialisierte rHDL, bestehend aus einem Apolipoprotein-Gerüst und dem anionischen Glycerophospholipid Cardiolipin, in Ligandenbindungsstudien eingesetzt. Diese Partikel bieten eine Plattform für Studien zur Wechselwirkung von Cardiolipin mit verschiedenen wasserlöslichen Liganden, darunter Calcium, Cytochrom c und das Krebsmittel Doxorubicin8.

Der Fokus der vorliegenden Arbeit liegt auf der Formulierung von rHDL, die einen stabil eingebauten hydrophoben bioaktiven Wirkstoff (d.h. Nanodisk) besitzen. Die Fähigkeit dieser Wirkstoffe, sich in das Lipidmilieu von scheibenförmigen rHDL-Partikeln zu integrieren, verleiht ihnen effektiv eine wässrige Löslichkeit. Daher haben Nanoscheiben das Potenzial für therapeutische Anwendungen in vivo . Bei der Formulierung von Nanoscheiben sind bestimmte Inkubations-/Reaktionsbedingungen erforderlich, um diskrete hydrophobe bioaktive Wirkstoffe erfolgreich in das Produktpartikel einzubauen, und das Ziel dieses Berichts ist es, detaillierte praktische Informationen bereitzustellen, die als grundlegende Vorlage für die Herstellung neuartiger Nanoscheibenpartikel für bestimmte Anwendungen verwendet werden können. Daher sind die Begriffe Nanodisc und Nanodisk im Kontext dieses Manuskripts nicht austauschbar. Während sich Nanodisc auf ein rHDL bezieht, das so formuliert ist, dass es ein Transmembranprotein enthält, das in seine Lipiddoppelschicht5 eingebettet ist, bezieht sich der Begriff Nanodisk auf ein rHDL, das so formuliert ist, dass es hydrophobe bioaktive Wirkstoffe mit niedrigem Molekulargewicht (< 1.000 Da), wie z. B. Amphotericin B14, enthält.

Für die Gewinnung geeigneter Gerüstproteine stehen eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung. Es ist möglich, Gerüstproteine von Herstellern zu kaufen [z. B. apoA-I (SRP4693) oder apoE4 (A3234)], jedoch können die Kosten ein limitierender Faktor sein. Ein bevorzugter Ansatz ist die Expression rekombinanter Gerüstproteine in Escherichia coli. Es wurden Protokolle für humane apoA-I9, apoE410 sowie das Insekten-Hämolymphprotein Apolipophorin-III11 veröffentlicht. Für die Zwecke der hierin beschriebenen Experimente wurde eine rekombinante humane apoE4 N-terminale (NT) Domäne (Aminosäuren 1-183) verwendet. Die Nukleotidsequenz, die für humanes apoE4-NT kodiert, wurde synthetisiert und in einen pET-22b (+) Expressionsvektor eingefügt, der direkt an die vektorkodierte pelB-Leader-Sequenz angrenzt. Dieses Konstrukt führt zur Expression eines pelB-Leader-Sequenz-apoE4-NT-Fusionsproteins. Nach der Proteinsynthese leitet die bakterielle pelB-Leader-Sequenz das neu synthetisierte Protein in den periplasmatischen Raum, wo die Leader-Peptidase die pelB-Sequenz spaltet. Das resultierende apoE4-NT-Protein ohne Sequenzmarkierungen oder Schwänze entweicht anschließend den Bakterien und reichert sich im Nährmedium11,12 an, was die nachgelagerte Verarbeitung vereinfacht.

Protocol

1. Transformation, Expression und Aufreinigung der Gerüstproteinkomponente BL21 bakterielle Transformation mit apoE4-NT enthaltendem PlasmidTauen Sie ein Röhrchen mit BL21 (DE3)-kompetenten Zellen 10 Minuten lang auf Eis auf. Sobald das gesamte Eis geschmolzen ist, mischen Sie vorsichtig und pipettieren Sie vorsichtig 50 μl der Zellen in ein Transformationsröhrchen auf Eis. Fügen Sie der Zellmischung 5 μl mit 50 ng Plasmid-DNA (für die Sequenz siehe …

Representative Results

Bioaktiver Wirkstoff Nanodisk-FormulierungsprozessBei dem beschriebenen ampB-Nanodisk-Formulierungsverfahren gilt die Reaktion als abgeschlossen, wenn das Erscheinungsbild der Probe von trüb zu klar übergeht (Abbildung 1). Diese Veränderung deutet darauf hin, dass sich Nanoscheiben gebildet haben und der bioaktive Wirkstoff solubilisiert wurde. Häufig absorbieren bioaktive Wirkstoffe Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich (z. B. ampB, Curcumin, Lutein, Coenzym Q<su…

Discussion

Die Formulierung eines bioaktiven Wirkstoffs, der Nanoscheiben enthält, stellt eine bequeme Methode zur Solubilisierung ansonsten unlöslicher hydrophober Verbindungen dar. Da das Produkt nanoaktive Wirkstoff-Nanoscheiben in wässrigen Medien vollständig löslich sind, bieten sie eine nützliche Verabreichungsmethode für eine Vielzahl von hydrophoben Molekülen (Tabelle 1). Dazu gehören kleine Moleküle, natürliche und synthetische Medikamente, sekundäre Pflanzenstoffe, Hormone usw. Die Formulierun…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der National Institutes of Health (R37 HL-64159) unterstützt.

Materials

Amphotericin B Cayman Chemical Company 11636 ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin Fisher Scientific BP17925 Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid GenScript N/A Transformation
Baffled Flask New Brunswick Scientific N/A Expansion & Expression
BL21 competent E coli New England Biolabs C2527I Transformation
Centrifuge bottles Nalgene 3140-0250 Expression
Chloroform Fisher Scientific G607-4 ND Formulation
DMSO Sigma Aldrich 472301 Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine Avanti Lipids 850345P ND Formulation
Erlenmeyer flask Bellco Biotechnology N/A Expansion & Expression
Falcon Tubes Sarstedt Ag & Co D51588 Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes VWR 47729-570 ND Formulation
GraphPad (Software) Dotmatics N/A Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath VWR N/A ND Formulaton
Heating and Nitrogen module Thermo Scientific TS-18822 ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL) GE Healthcare 17-0407-03 Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside  Fisher Scientific BP1755 Expression
J-25 Centrifuge Beckman Coulter J325-IM-2 Expression
JA-14 Rotor Beckman Coulter 339247 Expression
Lyophilizer Labconco 7755030 ND Formulation
Methanol Fisher Scientific A452-4 ND Formulation
Nitrogen gas Praxair UN1066 ND Formulation
NZCYM media RPI Research Products N7200-1000.0 Expansion & Expression
Pet-22B vector GenScript N/A Transformation
Petri dish Fisher Scientific FB0875718 Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes Fisher Brand 14385 928A Spectral Analysis
Shaking Incubator New Brunswick Scientific M1344-0004 Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys Thermo Scientific 66430 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 68100 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 88243 Purification
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Purification
Sodium Phosphate dibasic Fisher Scientific S374-500 Purification
Sodium Phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500 Purification
Spectra/POR Weighted Closures Spectrum Medical Industries 132736 Purification
Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 220-92961-01 spectral analysis
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 366816 ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software) Shimadzu N/A Spectral Analysis
Vacuum filter Millipore 9004-70-0 Expression & Purification
Vacuum pump GAST Manufacturing Inc DOA-P704-AA Expression & Purification
Vortex Fisher Scientific 12-812 ND Formulation
Yeast N/A BY4741 Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose BD 242820 Yeast Viability Assay

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Diesen Artikel zitieren
Lethcoe, K., Fox, C. A., Moh, I., Swackhamer, M., Karo, M., Lockhart, R., Ryan, R. O. Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks. J. Vis. Exp. (193), e65145, doi:10.3791/65145 (2023).

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