Dit protocol maakt het mogelijk om de impact van profagen op hun gastheren te onthullen. Bacterieculturen worden gesynchroniseerd met behulp van omstandigheden die de lysogene toestand het beste ondersteunen, waardoor spontane inductie wordt beperkt. RT-qPCR maakt ondubbelzinnig onderscheid tussen profaagbeperkte genen en genen die zijn losgekoppeld van faagcontrole en genen die tot expressie worden gebracht tijdens de lytische replicatiecyclus.
Gematigde fagen worden als profagen geïntegreerd aangetroffen in de meeste bacteriële genomen. Sommige profagen zijn cryptisch en gefixeerd in het bacteriële chromosoom, maar andere zijn actief en kunnen spontaan of door blootstelling aan inducerende factoren in een replicatieve vorm worden geactiveerd. Profagen worden vaak geassocieerd met het vermogen om toxineproductie of andere virulentie-geassocieerde eigenschappen aan hun gastheercel te verlenen. Recentere studies hebben aangetoond dat ze een veel grotere rol kunnen spelen bij het veranderen van de fysiologie van hun gastheren. De hier beschreven techniek heeft ons in staat gesteld om te onderzoeken hoe profagen de genexpressie beïnvloeden in de opportunistische bacterie Pseudomonas aeruginosa.
In dit werk werd de groei van de wild-type P. aeruginosa stam PAO1 vergeleken met die van isogene lysogenen die verschillende combinaties van profagen van de Liverpool Epidemic Strain (LES) LESB58 dragen. In een lysogeenkweek zal een deel van de bacteriële cellen de lytische bacteriofaagreplicatie (spontane inductie) ondersteunen met een hoog niveau van expressie per cel van late faaggenen, zoals die geassocieerd zijn met de assemblage van faagdeeltjes, waardoor de genexpressie op laag niveau wordt gemaskeerd die geassocieerd is met lysogeenbeperkte genexpressie. De impact van spontane inductie kan dus de genexpressie van profaagen in een lysogene populatie verdoezelen.
Groeiprofileringsexperimenten werden gebruikt om spontane inductie te identificeren, die minimaal was tijdens de vroege exponentiële groeifase. Deze studie rapporteert hoe monsterculturen kunnen worden bereid tijdens de vroege exponentiële groeifase en hoe adequate controles kunnen worden opgezet ondanks lage celaantallen. Deze protocollen zorgen voor een betrouwbare en reproduceerbare vergelijking van wildtype en lysogene bacteriën onder verschillende omstandigheden, waardoor de transcriptomische profilering van profaggenomen wordt verbeterd en wordt geholpen bij de identificatie van voorheen niet-herkende profagefuncties.
Onlangs hebben faagtherapie voor de aanpak van antimicrobiële resistentie1 en CRISPR-Cas-gebaseerde genbewerking2 hernieuwde belangstelling gewekt voor bacteriofaagonderzoek. Nogmaals, de vooruitgang in de biotechnologie heeft het mogelijk gemaakt om dieper onderzoek te doen naar de interacties tussen bacteriën en fagen3. Het therapeutisch gebruik van fagen (“faagtherapie”) wordt echter belemmerd door bezorgdheid over fagen die fungeren als mobiele genetische elementen met het vermogen om virulentie- en resistentiegenen horizontaal over te dragen4. De uitgestrektheid van “donkere materie”5 (genen met onbekende functies) is zowel verontrustend als aanlokkelijk. Donkere materie wordt beschouwd als een hiaat in ons begrip van faagbiologie en een grotendeels onaangeboorde bron voor moleculaire hulpmiddelen en potentiële nieuwe therapieën6. De ontwikkeling van high-throughput sequencing-technieken, samen met verbeterde genannotatie 7,8,9 en nieuwe peptide-vouwalgoritmen10, verbetert de detectie, beschrijving en functionele voorspelling van faaggenen. De wetenschap is echter nog ver verwijderd van het valideren van de genfuncties van de meeste fagen in cultuur of in de echte wereld.
RNA-sequencing (RNA-Seq) kan genexpressie tijdens faaginfectie globaal in kaart brengen en heeft het begrip van zowel de faag- als de bacteriële elementen die betrokken zijn bij lytische en lysogene cycli aanzienlijk verbeterd11,12. Tijdens lysogene processen worden gematigde faaggenomen geïntegreerd in bacterieel DNA om profagen te worden13. Globale experimenten met genexpressieprofilering kunnen worden gebruikt om profaag-beperkte genen te identificeren die gecodeerd zijn op gematigde faaggenomen, maar alleen tot expressie komen tijdens de lysogene toestand11. Dergelijke genen coderen niet voor structurele faageiwitten en zijn niet betrokken bij faaginfectieprocessen. RNA-Seq kan worden gebruikt om die genen te identificeren die meer kans hebben om de biologie van de bacteriële gastheer te beïnvloeden, hetzij door een functiewinst te induceren, hetzij door de bestaande bacteriële genen te reguleren, waardoor de bacteriën zich vaak kunnen aanpassen aan veranderende omgevingen. Daarom zou het vermogen van profagen om te fungeren als microbiële poppenmeesters, die een reeks bacteriële functies beheersen, kunnen worden bestudeerd.
Er zijn twee belangrijke barrières voor de effectieve analyse van profaag-beperkte genexpressie. Ten eerste is de beschikbaarheid van gevoelige hosts een belangrijk punt. Per definitie zijn profagen al opgenomen in hun specifieke gastheergenoom, dus het is een uitdaging om een vatbare wild-type gastheer te vinden om de globale genexpressie te vergelijken in de aan- en afwezigheid van het profag. Dit kan worden bereikt door de novo infectie van een andere vatbare gastheer of door de deletie van de profag uit het oorspronkelijke wildtype-isolaat, zonder de rest van het gastheergenoom te verstoren. De tweede barrière ligt in de heterogene aard van lysogene populaties. Sommige profagen worden door mutatie of recombinatie afgebroken om “cryptisch” te worden, wat betekent dat ze op een specifieke locatie van het bacteriële genoom zijn gefixeerd. Andere profagen zijn echter “actief” en kunnen spontaan of na blootstelling aan inducerende factoren in een replicatieve, lytische cyclus worden geïnduceerd. In veel lysogene culturen betekent de snelheid van spontane inductie dat een deel van de bacteriële cellen altijd lytische faagreplicatie ondergaat14,15,16. Een hoog niveau van expressie van late faaggenen in deze populaties maskeert de genexpressie op laag niveau geassocieerd met lysogeenbeperkte genexpressie11,17. Het percentage lysogenen dat spontane profage-inductie ondergaat, kan variëren met de groeitoestand, groeiomstandigheden of andere triggers. Daarom, om de effecten van profagen op het lysogeen te bestuderen, moeten spontane profage-inductiegebeurtenissen zoveel mogelijk worden geminimaliseerd door de groeiomstandigheden te optimaliseren om de lysogene toestand te bevorderen.
Deze studie rapporteert het voorbereidende werk dat is gedaan om de invloed te onderzoeken van een reeks samenwonende profagen van de Liverpool Epidemic Strain (LES) van Pseudomonas aeruginosa. Actieve profagen werden geïnduceerd en geïsoleerd uit LES en gebruikt om de gastheerstam van het model P. aeruginosa, PAO116,18,19, te infecteren. Het hele genoom van de wildtype P. aeruginosa-stam, PAO1, en zijn lysogeen, PAO1Φ2, werd gesequenced (op een diepte van 30x dekking) om de identiteit van de wildtypestam te verzekeren en om te bevestigen dat het lysogeen was. De LES is in verband gebracht met verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij patiënten met cystische fibrose, en LES-fagen 19 zijn gesuggereerd om de aanpassing aan de cystische fibrose-longomgeving te helpen16,19,20. Ondanks sterk bewijs dat deze profagen de biologie van hun gastheer beïnvloeden20,21, moeten de meeste van hun genfuncties nog worden gekarakteriseerd en worden de specifieke interactiemechanismen slecht begrepen. Een transcriptomics-benadering kan empirisch de functies van het profagegenen blootleggen in een gecontroleerde gastheerachtergrond. Aangezien spontane inductie de expressieprofielen kan beïnvloeden, wordt in dit artikel beschreven hoe de groeiomstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd om de lysogene toestand te bevorderen. Een dergelijke synchronisatie van culturen kan worden gevalideerd door real-time PCR om de expressieniveaus te kwantificeren van belangrijke genetische markers die geassocieerd zijn met cruciale stadia van LES-faagreplicatie in PAO1. Dezelfde benadering is eerder gebruikt om de profaag-beperkte functies van Shiga-toxigene fagen te identificeren die de beweeglijkheid, zuurresistentie en antimicrobiële resistentie beïnvloeden in Escherichia coli11,17,21,22.
De creatie van een selecteerbare indicatorgastheer, die eerder werd gebruikt in plaque-assays om de spontane inductie van Stx-faag uit E. coli MC106137,38,39 nauwkeuriger te kwantificeren, is hier beschreven voor P. aeruginosa-faag LESΦ2. Deze interventie heeft als bijkomend voordeel dat de stappen en tijd voor de verwerking van het monster worden verminderd, waardoor de gelijktijdige beoordeling van spontane inductiesnelheden in meerdere kweekomstandigheden mogelijk wordt. Er bestaat een risico op het genereren van andere mutaties tijdens de creatie van rifampicine-resistente varianten40; In dit werk werd de geëvolueerde stam echter alleen gebruikt als indicatorgastheer voor de telling van plaques uit culturen van belang en werd deze niet opgenomen in de transcriptomische analyse. Zolang de selecteerbare indicatorstam even vatbaar blijft voor infectie door de faag van belang, is er geen bezorgdheid over andere verworven mutaties. Desalniettemin werden er geen verschillen in de polymorfismeprofielen van het restrictiefragment gedetecteerd door de pulsveldgelelektroforese (PFGE)-analyse van PAO1WT en PAO1RIF (gegevens niet getoond).
Bij het kiezen van gastheercellen is het zeldzaam om een indicatorstam te vinden die niet al profagen herbergt. PAO1 herbergt bijvoorbeeld de draadvormige profaage Pf4. De experimentele controles voor deze studie waren ontworpen om de genexpressie van specifieke fagen (in dit geval LES-profag 2) en de effecten die deze faag heeft op bacteriële genexpressie direct te kunnen onderzoeken. In de vergelijking van transcripties van PAO1 met de LES-propagage 2 en zonder de LES-propagage 2 (zowel lysogeen als niet-lysogeen dragen het endogene Pf4), die dienen als interne controles om de impact van Pf4 op de gastheer uit te sluiten. Bovendien is aangetoond dat Pf4 meestal geen lysis veroorzaakt in zijn gastheercel41 en daarom niet in staat is om de resultaten van deze experimenten te verstoren.
Het is algemeen bekend dat zorgvuldige kwaliteitscontrole cruciaal is bij de voorbereiding van monsters voor het produceren van zinvolle omics-gegevens42. Zoals eerder beschreven11, wordt de zorgvuldige karakterisering van profage-activiteit bij de bereiding van lysogeculturen voor dergelijke studies echter zelden uitgevoerd. Hier beschrijven we onze systematische protocollen voor het voorbereiden van een goed gecontroleerde en geoptimaliseerde set culturen voor transcriptomische studies om de interacties tussen bacteriën en gematigde fagen beter te onderzoeken. De synchroniciteit van de populatie werd gecontroleerd door de cultuur door ten minste vier verdubbelingen te brengen voordat deze werd behandeld met het inducerende antibioticum norfloxacine. Door de MIC van norfloxacine voor de stam in het onderzoek te bepalen, konden we ervoor zorgen dat de concentratie van het inducerende middel net boven de MIC lag voor de “inductie”-behandeling. De behandelde cellen werden vervolgens 1:10 verdund om de norfloxacineconcentratie na de behandeling van 1 uur onder de MIC te verlagen, zodat de cellen zich konden herstellen en het faagreplicatieproces konden voltooien, eindigend in de lysis van de cel en het vrijkomen van infectieuze faagnakomelingen. De cellen gaan pas na de inductiestimulus de lytische replicatiecyclus in als de concentratie norfloxacine tijdens de herstelperiode onder de MIC is gebracht. In dit geval betekent een stijging van meer dan 1 μg·ml−1 norfloxacine dat het geneesmiddel niet effectief kan worden verdund onder de MIC, aangezien de MIC voor norfloxacine voor PAO1 0,19 μg·mL−1 is. Het niveau van de verdunning van de inductor moet in evenwicht zijn met de behoefte aan lysogeenterugwinning en het behoud van de kweekdichtheid voor het oogsten van het RNA. De hier besproken gegevens tonen aan dat het mogelijk is om culturen te synchroniseren om monsters te maken waarin lysogenie domineert, waardoor de ruis van spontane inductie wordt verminderd en de detectie van echte lysogenie-gedreven veranderingen in genexpressie mogelijk wordt. Aangezien de lysogene toestand overheersend is in de vroeg-exponentiële groeifase wanneer de bacteriële celdichtheid laag is, raden we aan om de culturen op te schalen om voldoende RNA te oogsten voor latere genexpressiestudies zoals RNA-Seq.
Het gebruik van norfloxacine als inducerend middel om culturen in de lytische cyclus te dwingen is goed gerapporteerd43,44; Dit zal echter ook de expressie van andere bacteriële genen in het proces beïnvloeden45,46. Om dit te beperken, moeten RNA-bibliotheken van controle-wildtypeculturen die onder dezelfde inducerende en niet-inducerende omstandigheden worden gekweekt, worden opgenomen in RNA-Seq-experimenten. Het gebruik van interne controles en belangrijke markergenen om de stadia van faagreplicatie door qRT-PCR te valideren, is ook cruciaal voor nauwkeurige vergelijkingen. Kwantitatieve RT-PCR-profilering kan niet worden geïnterpreteerd door de absolute aantallen transcripten voor elk gen op verschillende tijdstippen te vergelijken; Het is de vorm van het profiel die telt. Ten eerste is slechts één klein gebied in het transcript voor een gen bemonsterd, dus of het een kortlevend of langlevend element is, is onbekend27. Zeker, RNA-Seq-mapping van transcripten laat zien dat de dichtheid van de mappinggegevens aanzienlijk varieert over de lengte van een gen. Ten tweede is het de vorm van het genexpressieprofiel dat moet worden geïnterpreteerd voor een markergen dat geassocieerd is met de lytische cyclus of de lysogene levensstijl of zelfs losgekoppeld is van de faagregulerende circuits11. Spontane inductie is een reëel probleem in lysogeenkweek en zal altijd resulteren in de expressie van lytische cyclus-geassocieerde genen. Profilering toont echter wel aan dat de genen die geassocieerd zijn met de lytische replicatiecyclus worden onderdrukt in hun expressie pre-inductie (ten minste twee logvouwen) en opwaarts gereguleerd na inductie.
De eerder uitgevoerde transcriptomische analyses van Stx-faaginteracties met E. coli ondersteunen een grondig begrip van de faaggenen die betrokken zijn bij het handhaven van lysogenie en het activeren van de lytische cyclus11,17. Momenteel zijn de LES-fagen van P. aeruginosa geannoteerd, maar hun belangrijkste genfuncties zijn minder goed begrepen. Transcriptomische studies zullen de herannotatie van de LES-profagen mogelijk maken en ons begrip van de genen die betrokken zijn bij de lysogene en lytische cyclus verbeteren. Het koppelen van gensequentie aan functie vormt een grote uitdaging in de studie van nieuwe profagen, wat verder benadrukt dat er meer studies nodig zijn om de faaggenfuncties te bevestigen voor de productie van betere annotatietools47. De bredere toepassing en aanpassing van de protocollen en extra kwaliteitscontrolemaatregelen die in dit videoartikel worden beschreven, kunnen helpen bij het onthullen van verschillende profagefuncties en zo bij het verbeteren van annotatiepijplijnen en het transformeren van ons begrip van faag- en bacteriële biologie.
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |