AMEBaS : Extraction automatique de la ligne médiane et soustraction de l’arrière-plan des time-lapses de fluorescence ratiométrique de cellules uniques polarisées

La polarité cellulaire est un processus biologique fondamental dans lequel l’action concertée d’un ensemble de molécules et de structures concentrées dans l’espace aboutit à l’établissement de domaines morphologiques subcellulaires spécialisés¹. La division, la croissance et la migration cellulaires dépendent de ces sites de polarité, tandis que sa perte a été associée au cancer dans les troubles liés aux tissus épithéliaux².

Les cellules à croissance apicale sont un exemple dramatique de polarité, où le site de polarité à l’extrémité se réoriente généralement vers des signaux extracellulaires³. Il s’agit notamment des neurites en développement, des hyphes fongiques, des poils racinaires et des tubes polliniques, où de multiples processus cellulaires présentent des différences prononcées de l’extrémité de la cellule vers la tige. Dans les tubes polliniques, en particulier, la polymérisation de l’actine, le trafic des vésicules et les concentrations ioniques sont nettement polarisés, montrant des gradients focalisés sur la pointe⁴. Les tubes polliniques sont les gamétophytes mâles des plantes à fleurs et sont responsables de l’acheminement des spermatozoïdes vers l’ovule en se développant exclusivement à l’apex de la cellule à l’un des taux de croissance les plus rapides connus pour une seule cellule. Les gradients focalisés sur la pointe des ions tels que le calcium 5 (Ca²+) et les protons 6 (H⁺) jouent un rôle majeur dans le maintien de la croissance du tube pollinique, ce qui est essentiel pour accomplir sa fonction biologique principale qui aboutit à une double fécondation ^5,6. Ainsi, les méthodes quantitatives d’analyse de la dynamique spatio-temporelle le long de la ligne médiane des cellules à croissance apicalle sont essentielles pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la croissance polarisée ^7,8,9. Les chercheurs utilisent souvent des kymographes, c’est-à-dire une matrice qui représente l’intensité des pixels de la ligne médiane de la cellule (p. ex., les colonnes) dans le temps (p. ex., les lignes), ce qui permet de visualiser la croissance et la migration des cellules en diagonale (figure 1). Malgré leur utilité, les kymographes sont souvent extraits en traçant manuellement la ligne médiane, étant sujets à des biais et à des erreurs humaines tout en étant plutôt laborieux. Cela nécessite une méthode automatisée d’extraction de la ligne médiane qui est la première caractéristique du pipeline présenté ici et qui est appelée AMEBaS : unextraction utomatique Midline Eet Background Subtraction des timelapses de fluorescence ratiométriques de cellules uniques polarisées.

En termes de procédures expérimentales, l’imagerie quantitative d’ions/molécules/espèces d’intérêt dans des cellules individuelles peut être réalisée avec des sondes fluorescentes génétiquement codées¹⁰. Parmi les choix en constante expansion, les sondes ratiométriques sont l’une des plus précises car elles émettent différentes longueurs d’onde de fluorescence lorsqu’elles sont liées/non liées aux molécules d’intérêt¹¹. Cela permet de corriger l’hétérogénéité spatiale de la concentration intracellulaire de la sonde en utilisant le rapport de deux canaux avec leur bruit de fond spécifique au canal soustrait. Cependant, l’estimation du seuil d’arrière-plan pour chaque canal et point temporel peut être une tâche complexe car il varie souvent dans l’espace en raison d’effets tels que l’ombrage, où les coins de l’image ont une variation de luminosité par rapport au centre, et dans le temps en raison de la décoloration du fluorophore (photoblanchiment)¹². Bien qu’il existe plusieurs méthodes possibles, ce manuscrit propose de déterminer automatiquement l’intensité du bruit de fond à l’aide du seuil de segmentation obtenu avec l’algorithme Isodata¹³, qui est ensuite lissé à travers les trames par régression polynomiale comme norme. Cependant, les composantes spatiales issues de l’hétérogénéité de fluorescence non liées à la cellule cible éliminée dans¹² ont été ignorées par cette méthode. Le seuillage automatique peut être effectué par plusieurs méthodes, mais l’algorithme Isodata a produit les meilleurs résultats empiriques. Ainsi, la soustraction automatique de la valeur de fond et le calcul ratiométrique sont la deuxième caractéristique principale d’AMEBaS (Figure 1), qui, pris ensemble, reçoit en entrée une pile d’images de microscopie à fluorescence à double canal, estime la ligne médiane de la cellule et le fond spécifique au canal, et produit des kymographes des deux canaux et de leur rapport (sortie principale #1) après soustraction de l’arrière-plan, lissage et suppression des valeurs aberrantes, ainsi qu’une pile d’images ratiométriques (sortie principale #2).

AMEBaS a été testé avec des time-lapses de fluorescence de tubes polliniques d’Arabidopsis en croissance obtenus au microscope, soit avec des capteurs ratiométriques Ca²⁺ (CaMeleon)⁸ ou pH (pHluorin)⁶ exprimés sous le promoteur LAT52 spécifique au pollen. Les images de chaque canal ont été prises toutes les 4 s couplées à un microscope inversé, une caméra frontale éclairée (2560 pixels × 2160 pixels, taille de pixel 6,45 μm), un illuminateur à fluorescence et un objectif à immersion dans l’eau 63x, 1,2NA. Les réglages des filtres utilisés pour CaMeleon étaient : excitation 426-450 nm (CFP) et 505-515 nm (YFP), émission 458-487 nm (CFP) et 520-550 nm (YFP), tandis que pour pHluorin, excitation 318-390 nm (DAPI) et 428-475 nm (FITC), émission 435-448 nm (DAPI) et 523-536 nm (FITC). Un ensemble complet de données a été ajouté pour les tests chez Zenodo (DOI : 10.5281/zenodo.7975350)¹⁴.

De plus, le pipeline a été testé avec des données sur les poils racinaires, où l’imagerie a été réalisée avec un microscope à feuille de lumière (SPIM) comme décrit précédemment ^15,16 avec des poils racinaires d’Arabidopsis exprimant le rapporteur Ca²⁺ génétiquement codé NES-YC3.6 sous le contrôle du promoteur UBQ10¹⁷. Le logiciel maison LabView qui contrôlait l’acquisition de la caméra, la translation de l’échantillon et l’obturateur du microscope à nappe de lumière a permis l’observation des deux canaux cpVenus et CFP, mais aussi la visualisation de leur rapport en temps réel. Chaque image de rapport du time-lapse représentait une projection d’intensité maximale (MIP) entre les images des canaux fluorescents cpVenus et CFP obtenues à partir de 15 tranches de l’échantillon espacées de 3 μm. Le rapport cpVenus/CFP en time-lapse des MIP a été enregistré et directement utilisé pour l’analyse AMEBaS.

Bien que ce pipeline puisse fonctionner avec plusieurs types de cellules en croissance et en migration, il a été spécialement conçu pour analyser les cellules en croissance qui se développent exclusivement à l’extrémité, telles que les tubes polliniques, les poils racinaires et les hyphes fongiques, où il existe une correspondance des régions cytoplasmiques non croissantes entre les cadres. En l’absence d’une telle correspondance, l’utilisateur doit choisir l’option complete_skeletonization à l’étape 1.3.1.1 (voir la section Discussion pour plus de détails).

Figure 1 : Vue d’ensemble du flux de travail du pipeline. Le pipeline AMEBaS analyse et traite les timelapses microscopiques en trois étapes principales : la segmentation d’une cellule unique, le traçage de la ligne médiane et la génération de kymographes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.