Summary

Mouse In Vivo Placental Alvo CRISPR Manipulação

Published: April 14, 2023
doi:

Summary

Aqui descrevemos um método tempo-específico para manipular efetivamente vias críticas de desenvolvimento na placenta de camundongos in vivo. Isto é realizado através da injeção e eletroporação de plasmídeos CRISPR nas placentas de fêmeas grávidas no dia embrionário 12.5.

Abstract

A placenta é um órgão essencial que regula e mantém o desenvolvimento dos mamíferos no útero. A placenta é responsável pela transferência de nutrientes e resíduos entre a mãe e o feto e pela produção e entrega de fatores de crescimento e hormônios. Manipulações genéticas placentárias em camundongos são críticas para a compreensão do papel específico da placenta no desenvolvimento pré-natal. Camundongos transgênicos que expressam Cre específicos da placenta têm eficácia variável, e outros métodos para manipulação gênica placentária podem ser alternativas úteis. Este artigo descreve uma técnica para alterar diretamente a expressão gênica placentária usando a manipulação do gene CRISPR, que pode ser usada para modificar a expressão de genes-alvo. Usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada, as fêmeas grávidas são submetidas a uma laparotomia no dia embrionário 12.5 (E12.5), e um plasmídeo CRISPR é entregue por uma micropipeta de vidro nas placentas individuais. O plasmídeo é eletroporado imediatamente após cada injeção. Após a recuperação da barragem, as placentas e embriões podem continuar o desenvolvimento até a avaliação em um momento posterior. A avaliação da placenta e da prole após o uso dessa técnica pode determinar o papel da função placentária tempo-específica no desenvolvimento. Esse tipo de manipulação permitirá uma melhor compreensão de como a genética e a função placentárias afetam o crescimento e o desenvolvimento fetal em múltiplos contextos patológicos.

Introduction

A placenta é um órgão essencial envolvido no desenvolvimento do feto. O principal papel da placenta é fornecer fatores essenciais e regular a transferência de nutrientes e resíduos de e para o feto. As placentas de mamíferos são compostas por tecido fetal e materno, que compõem a interface feto-materna e, portanto, a genética da função de impacto materno-fetal1. Anomalias genéticas ou função prejudicada da placenta podem alterar drasticamente o desenvolvimento fetal. Trabalhos anteriores mostraram que a genética e o desenvolvimento placentário estão associados ao desenvolvimento alterado de sistemas orgânicos específicos no feto. Particularmente, anormalidades na placenta estão ligadas a alterações no cérebro, coração e sistema vascular fetal2,3,4,5.

O transporte de hormônios, fatores de crescimento e outras moléculas da placenta para o feto desempenha um papel importante no desenvolvimento fetal6. Tem sido demonstrado que alterar a produção placentária de moléculas específicas pode alterar o neurodesenvolvimento. A inflamação materna pode aumentar a produção de serotonina por alterar a expressão gênica metabólica do triptofano (TRP) na placenta, o que, posteriormente, cria um acúmulo de serotonina no cérebro fetal7. Outros estudos encontraram anormalidades placentárias ao lado de defeitos cardíacos. Acredita-se que anormalidades na placenta contribuam para defeitos cardíacos congênitos, o defeito congênito mais comum em humanos8. Um estudo recente identificou vários genes que têm vias celulares semelhantes na placenta e no coração. Se rompidas, essas vias podem causar defeitos em ambos os órgãos9. Os defeitos na placenta podem exacerbar defeitos cardíacos congênitos. O papel da genética e função placentária no desenvolvimento de sistemas de órgãos fetais específicos é um campo de estudo emergente.

Camundongos possuem placentas hemocoriais e outras características das placentas humanas, o que os torna modelos altamente úteis para o estudo de doenças humanas1. Apesar da importância da placenta, atualmente há uma falta de manipulações genéticas direcionadas in vivo. Além disso, atualmente há mais opções disponíveis para knockouts ou knockdowns do que manipulações de superexpressão ou ganho de função na placenta10. Existem várias linhas transgênicas de Cre-expressando para manipulação placentária-específica, cada uma em diferentes linhagens de trofoblastos em diferentes pontos de tempo. Estes incluem Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER, e Gcm1-Cre 11,12,13,14. Embora esses transgenes Cre sejam eficientes, eles podem não ser capazes de manipular alguns genes em pontos de tempo específicos. Outro método comumente utilizado para nocautear ou superexpressar a expressão gênica placentária é a inserção de vetores lentivirais em cultura de blastocisto, o que causa uma manipulação genética trofoblasto-específica15,16. Esta técnica permite uma mudança robusta na expressão gênica placentária no início do desenvolvimento. O uso de RNA de interferência in vivo tem sido pouco utilizado na placenta. A inserção de plasmídeos de shRNA pode ser realizada de forma semelhante à técnica CRIPSR descrita neste trabalho. Isso foi feito no E13.5 para diminuir com sucesso a expressão de PlGF na placenta, com impactos na vasculatura cerebral da prole17.

Além das técnicas que são usadas principalmente para knockout ou knockdown, a indução da superexpressão é comumente realizada com adenovírus ou a inserção de uma proteína exógena. As técnicas utilizadas para superexpressão têm taxas variáveis de sucesso e têm sido realizadas, na maioria das vezes, mais tardiamente na gestação. Para investigar o papel do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) na função placentária, uma transferência gênica placentária mediada por adenovírus foi realizada para induzir a superexpressão do gene IGF-1 18,19. Isso foi realizado no final da gestação de camundongos com E18.5 por injeção direta na placenta. Para fornecer opções adicionais e contornar possíveis falhas de manipulações genéticas placentárias estabelecidas, como falhas na combinação Cre-Lox, a possível toxicidade de adenovírus e os efeitos fora do alvo do shRNA, a manipulação direta in vivo de CRISPR da placenta pode ser usada20,21,22. Este modelo foi desenvolvido para resolver a falta de modelos de superexpressão e para criar um modelo com flexibilidade.

Essa técnica é baseada no trabalho de Lecuyer e cols., no qual plasmídeos shRNA e CRISPR foram direcionados diretamente in vivo para placentas de camundongos para alterar a expressão de PlGF 17. Esta técnica pode ser usada para alterar diretamente a expressão gênica placentária usando a manipulação de CRISPR em vários pontos de tempo; para este trabalho, foi selecionado o E12.5. A placenta já amadureceu a esse ponto e é grande o suficiente para manipular, permitindo a inserção de um plasmídeo CRISPR específico no E12.5, o que pode ter um impacto significativo no desenvolvimento fetal a partir de meados da gestação23,24. Ao contrário das abordagens transgênicas, mas semelhantes às induções virais ou interferência de RNA, esta técnica permite a superexpressão ou knockout em pontos de tempo específicos usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada, evitando assim possível placentação prejudicada ou letalidade embrionária de alterações anteriores. Como apenas algumas placentas recebem o plasmídeo experimental ou de controle dentro de uma ninhada, a abordagem permite dois tipos de controles internos. Esses controles são aqueles injetados e eletroporados com o plasmídeo de controle apropriado e aqueles que não recebem manipulação direta. Esta técnica foi otimizada para criar uma superexpressão do gene IGF-1 na placenta de camundongos através de um plasmídeo CRISPR mediador de ativação sinérgica (SAM). O gene IGF-1 foi escolhido, pois o IGF-1 é um hormônio de crescimento essencial entregue ao feto que é primariamente produzido na placenta antes do nascimento25,26. Esta nova técnica CRISPR direcionada à placenta permitirá a manipulação direta para ajudar a definir a conexão entre a função placentária e o desenvolvimento fetal.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as regulamentações federais e a política da Universidade de Iowa e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. 1. Animais e criação Manter os animais em um ciclo diurno de 12 h com ração e água ad libitum. Use camundongos fêmeas CD-1 com idade entre 8-15 semanas. Utilizar a presença de um tampão copulatório para identificar o E0.5. Na E0.5, abri…

Representative Results

Resultados gerais do procedimento (Figura 6)No estudo, houve três grupos manipulados. Estes incluíram placentas injetadas com um plasmídeo de controle geral CRISPR Cas9 (Cas9 Control), um plasmídeo CRISPR de controle de ativação (Act Control), ou um plasmídeo de ativação de IGF-1 SAM (Igf1-OE). O Cas9 Control é mais adequado para plasmídeos knockout, e o controle de ativação é mais adequado para plasmídeos de superexpressão/ativa…

Discussion

A placenta é um regulador primário do crescimento fetal e, como observado anteriormente, alterações na expressão ou função gênica placentária podem afetar significativamente o desenvolvimento fetal6. O protocolo descrito aqui pode ser usado para realizar uma manipulação CRISPR in vivo direcionada da placenta de camundongo usando uma abordagem cirúrgica relativamente avançada. Esta técnica permite um rendimento significativo de embriões viáveis e suas placentas corresponden…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem as seguintes fontes de financiamento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 e NIH T32GM145441. Os autores agradecem aos laboratórios do Dr. Val Sheffield e do Dr. Calvin Carter na Universidade de Iowa pelo uso de sua sala de cirurgia e equipamentos, bem como ao Dr. Eric Van Otterloo, ao Dr. Nandakumar Narayanan, e ao Dr. Matthew Weber por sua assistência com microscopia. Os autores também agradecem à Dra. Sara Maurer, Maya Evans e Sreelekha Kundu por sua assistência com as cirurgias piloto.

Materials

1.5 ml Tubes USA Scientific Inc 1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS Thermo Fisher Scientific J61899.AP
96 Well plate Cornings 3598 For BCA kit
Absorbent Underpads Fisher Scientific 14-206-62
Activation Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-437275 Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0277L Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor Vetamac VAD-601TT VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel Akorn NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227 Protein quantification
Biovortexer Bellco Glass, Inc. 198050000 Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software Olympus V4.1.1 Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810 Eppendorf EP022628168 Plate centrifuge
Chloroform Thermo Fisher Scientific J67241-AP RNA isolation
Cotton Tipped Applicators ProAdvantage 77100 Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-418922 Dnase-free water provided for dilution
CryoStat Leica CM1950
Dissection Microscope Leica M125 C Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures Med Vet International J385H
Distilled Water Gibco 15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Thermo fisher Scientific 14190144 (-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0662 Generator only
Electric Razor Wahl CL9990 Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0487 3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK Grainger 21RK94 Placenta embedding cassettes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 268280010
F-Air Canisters Penn Veterinary Supply Inc BIC80120 Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF Sigma F7252-5G Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader) Fisher Scientific 14377576 Can be used for BCA and ELISA
Forceps VWR 82027-386 Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) Sutter Instrument B150-86-10 O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) Thermo Scientific 1861281 Protein homogenization buffer
Heating Pad Thermotech S766D Digitial Moist Heating Pad
Hemostats VWR 10806-188 Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath Fisher Scientific 20253 Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1) Santa Cruz Biotechnology sc-421056-ACT Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber Vetamac 941443 No specific liter size required
Isoflurane Piramal Pharma Limited NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal Fisher Scientific A451-4 RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml Akorn NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride Sigma Aldrich 63069-100ML 1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Fisher Scientific 4309849 Barcoded plates not required
Microcapillary Tip Eppendorf 5196082001 Attached to BTX Microinjector
Microinjector BTX Harvard Apparatus 45-0766 Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0751 MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97 Sutter Instrument P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker) scilogex 822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit R & D Systems MG100
Needles BD – Becton, Dickson, and Company 305106 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank Linde 7727-37-9 Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) Norbrook Laboratories Limited NDC 55529-040-10 Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone Vetamac 921609 9-14 mm
Opal 620 detection dye Akoya Biosciences SKU FP1495001KT Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound Sakura 4583
Oxygen Tank Linde 7782 – 44 – 7 Medical grade oxygen
Pestles USA Scientific Inc 14155390
Povidone-Iodine Solution, 5% Avrio Health L.P. NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4367659 Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers) New England Biolabs S1330S Use for cDNA synthesis
Razor Blade Grainger 26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator Zymo Research R1013
RNALater Thermo Fisher Scientific AM7021
RNAscope kit v.2.5 Advanced Cells Diagnostics 323100 Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 Advanced Cells Diagnostics  528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 Advanced Cells Diagnostics 527421
Roto-Therm Mini Benchmark R2020 Dry oven for in situ hybridization
Scissors VWR 82027-578 Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂
Sodium Chloride (Saline) Hospra NDC 0409-4888-03 Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] Research Product International 03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical Fisher Scientific SS277 Protein homogenization buffer
Steamer Bella B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape Busse 696 Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgipath Cover Glass 24×60 Leica 3800160
Syringes BD – Becton, Dickson, and Company 309659 BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer Fisher Scientific 13-400-525 This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive 3M 1469SB VetBond
Tris HCl Thermo Fisher Scientific 15568025 1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation
TSA Buffer Pack Advanced Cells Diagnostics 322810 Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit Vetamac 40200 Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope Olympus BX61VS Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI Vector Laboratories H-1200 Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block Thermo Fisher Scientific 4453536 This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color Amazon C450B
Xylazine 20mg/ml Anased 343730_RX

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Diesen Artikel zitieren
Carver, A. J., Taylor, R. J., Stevens, H. E. Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation. J. Vis. Exp. (194), e64760, doi:10.3791/64760 (2023).

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