Aqui, é demonstrado como um modelo de traumatismo cranioencefálico fechado acordado pode ser usado para examinar os efeitos do traumatismo cranioencefálico leve repetido (r-mTBI) na plasticidade sináptica no hipocampo. O modelo replica características importantes do r-mTBI em pacientes e é usado em conjunto com a eletrofisiologia in vitro .
Lesões cerebrais traumáticas leves (TCEm) são um problema de saúde prevalente na América do Norte. Há uma pressão crescente para utilizar modelos ecologicamente válidos de TCEm de cabeça fechada no contexto pré-clínico para aumentar a traduzibilidade para a população clínica. O modelo de lesão com cabeça fechada em vigília (ACHI) utiliza um impactor cortical controlado modificado para realizar o traumatismo cranioencefálico fechado, induzindo déficits comportamentais clinicamente relevantes sem a necessidade de craniotomia ou uso de anestésico.
Essa técnica normalmente não induz fatalidades, fraturas cranianas ou hemorragias cerebrais, e é mais consistente por ser uma lesão leve. De fato, a natureza leve do procedimento ACHI o torna ideal para estudos que investigam TCEm repetitivo (r-mTBI). Evidências crescentes indicam que o r-mTBI pode resultar em uma lesão cumulativa que produz sintomas comportamentais, alterações neuropatológicas e neurodegeneração. O r-mTBI é comum em jovens praticantes de esportes, e essas lesões ocorrem durante um período de robusta reorganização sináptica e mielinização, tornando a população mais jovem particularmente vulnerável às influências de longo prazo do r-mTBI.
Além disso, o r-mTBI ocorre em casos de violência por parceiro íntimo, uma condição para a qual há poucas medidas objetivas de rastreamento. Nesses experimentos, a função sináptica foi avaliada no hipocampo em ratos juvenis que haviam experimentado r-mTBI usando o modelo ACHI. Após as lesões, um fatiador de tecido foi utilizado para fazer cortes no hipocampo para avaliar a plasticidade sináptica bidirecional no hipocampo em 1 ou 7 dias após o r-mTBI. Em geral, o modelo ACHI fornece aos pesquisadores um modelo ecologicamente válido para estudar mudanças na plasticidade sináptica após mTBI e r-mTBI.
O traumatismo cranioencefálico (TCE) é um importante problema de saúde, com ~2 milhões de casos no Canadá e nos Estados Unidos a cada ano 1,2. O TCE afeta todas as faixas etárias e gêneros e tem uma taxa de incidência maior do que qualquer outra doença, incluindo câncer de mama, AIDS, doença de Parkinson e esclerose múltipla3. Apesar da prevalência do TCE, sua fisiopatologia permanece pouco compreendida e as opções de tratamento são limitadas. Em parte, isso ocorre porque 85% de todos os TCEs são classificados como leves (mTBI), e acredita-se que o mTBI produza apenas mudanças comportamentais limitadas e transitórias, sem consequências neuropsiquiátricas de longoprazo4,5. Atualmente, reconhece-se que a recuperação do TCEm pode levar de semanas aanos5,6, precipitar quadros neurológicos mais graves4 e que mesmo repetidos impactos “subconcussivos” afetam o cérebro7. Isso é alarmante, pois atletas de esportes como hóquei/futebol têm >10 impactos subconcussivos na cabeça por jogo/sessão de treino7,8,9,10.
Os adolescentes têm a maior incidência de TCEm e, no Canadá, cerca de um em cada 10 adolescentes procura atendimento médico por concussão relacionada ao esporteanualmente 11,12. Na realidade, qualquer impacto subconcussivo da cabeça ou TCEm pode causar danos difusos ao cérebro, e isso também poderia criar um estado mais vulnerável para lesões subsequentes e/ou condições neurológicas mais graves 13,14,15,16,17. No Canadá, é reconhecido legalmente pela lei de Rowan que lesões prévias podem aumentar a vulnerabilidade do cérebro a novas lesões18, mas a compreensão mecanicista do r-mTBI permanece lamentavelmente inadequada. Está claro, no entanto, que o TCEm único e o r-mTBI podem afetar a capacidade de aprendizagem durante os anosescolares 19,20, ter resultados específicos por sexo 21,22,23,2 4 e prejudicar a capacidade cognitiva mais tarde na vida16,25,26. De fato, análises de coorte associam fortemente o r-mTBI no início da vida com demência mais tarde27,28. O r-mTBI também está potencialmente associado à encefalopatia traumática crônica (ETC), que é caracterizada pelo acúmulo de proteína tau hiperfosforilada e atrofia cortical progressiva e precipitada por inflamação significativa 27,29,30,31. Embora as ligações entre r-mTBI e CTE sejam atualmente controversas32, esse modelo permitirá que elas sejam exploradas em maior detalhe em um cenário pré-clínico.
O TCEm é frequentemente descrito como uma “lesão invisível”, pois ocorre dentro de um crânio fechado e é difícil de detectar mesmo com técnicas modernas de imagem33,34. Um modelo experimental preciso de TCEm deve aderir a dois princípios. Primeiramente, deve-se recapitular as forças biomecânicas normalmente observadas na população clínica35. Em segundo lugar, o modelo deve induzir desfechos comportamentais heterogêneos, algo que também é altamente prevalente em populações clínicas36,37,38. Atualmente, a maioria dos modelos pré-clínicos tende a ser mais grave, envolvendo craniotomia, apoio cefálico estereotáxico, anestesia e impactos corticais controlados (ICC), que produzem danos estruturais significativos e déficits comportamentais mais extensos do que normalmente observados clinicamente33. Outra preocupação com muitos modelos pré-clínicos de concussão que envolvem craniotomias é que esse procedimento em si cria inflamação no cérebro, e isso pode exacerbar os sintomas de TCEm e neuropatologia de qualquer lesão subsequente39,40. A anestesia também introduz vários fatores de confusão complexos, incluindo a redução da inflamação 41,42,43, modulação da função microglial 44, liberação de glutamato45, entrada de Ca2+ através dos receptores NMDA 46, pressão intracraniana e metabolismo cerebral 47. A anestesia ainda introduz fatores de confusão, aumentando a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE), a hiperfosforilação da tau e os níveis de corticosteroides, enquanto reduz a função cognitiva 48,49,50,51. Além disso, lesões difusas fechadas de cabeça representam a grande maioria dos TCEm clínicos52. Eles também permitem estudar melhor a multiplicidade de fatores que podem influenciar os desfechos comportamentais, incluindo sexo21, idade 53, intervalo interlesão15, gravidade54 e número de lesões23.
A direção das forças acelerativas/desacelerativas (verticais ou horizontais) também é uma consideração importante para os resultados comportamentais e moleculares. Pesquisas de Mychasiuk e colaboradores compararam dois modelos de TCEm difuso de cabeça fechada: queda de peso (forças verticais) e impacto lateral (forças horizontais)55. Tanto a análise comportamental quanto a molecular revelaram desfechos heterogêneos dependentes do modelo e do sexo após o TCEm. Assim, modelos animais que ajudam a evitar procedimentos cirúrgicos, ao mesmo tempo em que incorporam forças lineares e rotacionais, são mais representativos das condições fisiológicas sob as quais essas lesões normalmente ocorrem33,56. O modelo ACHI foi criado em resposta a essa necessidade, permitindo a indução rápida e reprodutível de TCEm em ratos, evitando procedimentos (i.e., anestesia) que sabidamente enviesam as diferenças entre ossexos 57.
A maioria das pesquisas pré-clínicas tem utilizado modelos de TCEm que não recapitulam as forças biomecânicas observadas na população clínica. Aqui, mostra-se como o modelo ACHI pode ser usado para induzir r-mTBIs em ratos juvenis. Esse modelo fechado de r-mTBI apresenta vantagens significativas em relação aos procedimentos mais invasivos. Primeiro, o IHAC normalmente não causa fraturas cranianas, hemorragias cerebrais ou mortes, o que seria contraindicação de TCE “leve” em populações clínicas<sup class="…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a todos os membros do Laboratório Christie da Universidade de Victoria, do passado e do presente, por suas contribuições para o desenvolvimento deste protocolo. Este projeto foi apoiado com fundos dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR: FRN 175042) e NSERC (RGPIN-06104-2019). O gráfico do crânio da Figura 1 foi criado com o BioRender.
3D-printed helment | Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) | ||
Agarose | Fisher Scientific (BioReagents) | BP160500 | |
Anesthesia chamber | Home Made | N/A | Plexiglass Container |
Automatic Heater Controller | Warner Electric | TC-324B | |
Axon Digidata | Molecular Devices | 1440A | Low-noise Data Acquisition System |
Balance beam | Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick) | ||
Calcium Chloride | Bio Basic Canada Inc. | CD0050 | For aCSF |
Camera | Dage MTI | NC-70 | |
Carbogen tank | Praxair | MM OXCD5C-K | Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95% |
Clampex Software | Molecular Devices | Clampex 10.5 Version | |
Compresstome Vibrating Microtome | Precisionary | VF 310-0Z | |
Concentric Bipolar Electrode | FHC Inc. | CBAPC75 | |
Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific (Chemical) | D16-3 | aCSF |
Digital Stimulus Isolation Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 4D | |
Disodium Phosphate | Fisher Scientific (Chemical) | S373-500 | PBS |
Dissection Tools | |||
Feather Double Edge Blade | Electron Microscopy Sciences | 72002-10 | |
Filter Paper | Whatman 1 | 1001-055 | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
Hair Claw Clip | Can be obtained from any department store | ||
Home and Recovery Cages | Normal rat cages from animal care unit. | ||
Hum Bug Noise Eliminator | Quest Scientific | 726300 | |
Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
Isotemp 215 Digital Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-15 | |
Leica Impact One CCI unit | Leica Biosystems | Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip | |
Long-Evans rats, male | Charles River Laboratories (St. Constant, PQ) | ||
Low-Density Foam Pad | 3" polyurethane foam sheet | ||
Magnesium Chloride | Fisher Scientific (Chemical) | M33-500 | aCSF |
Male Long Evans Rats | Charles River Laboratories | Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria | |
MultiClamp 700B Amplifier | Molecular Devices | Model 700B | |
pH Test Strips | VWR Chemicals BDH | BDH83931.601 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific (Chemical) | P217-500 | aCSF, PBS |
Potassium Phosphate | Sigma | P9791-500G | PBS |
Push Button Controller | Siskiyou Corporation | MC1000e | Four-axis Closed Loop Controller Push-Button |
Sample Discs | ELITechGroup | SS-033 | For use with Vapor Pressure Osmometer |
Small towel | |||
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific (Chemical) | S233-500 | aCSF |
Sodium Chloride | Fisher Scientific (Chemical) | S271-3 | For aCSF, PBS |
Sodium Phosphate | Fisher Scientific (Chemical) | S369-500 | aCSF |
Soft Plastic Restraint Cones | Braintree Scientific | model DC-200 | |
Stopwatch | Many lab members use their iPhone for this | ||
Table or large cart with raised edges | For NAP and ACHI | ||
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament) | Sutter Instrument | BF150-110-10 | Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm |
Upright Microscope | Olympus | Olympus BX5OWI | 5x MPlan 0.10 NA Objective lens |
Vapor Pressure Osmometer | Vapro | Model 5600 | aCSF should be 300-310 mOSM |
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
Vibraplane Vibration Isolation Table | Kinetic Systems | 9101-01-45 |