Ensaio Pulldown Juntamente com Co-Expressão em Células de Bactérias como uma Ferramenta Eficiente em Tempo para Testar Interações Desafiadoras Proteína-Proteína

O pulldown convencional é amplamente utilizado para estudar as interações proteína-proteína¹. No entanto, as proteínas purificadas muitas vezes não interagem efetivamente in vitro^2,3, e algumas delas são insolúveis sem seu parceiro de ligação ^4,5. Tais proteínas podem necessitar de montagem co-translacional ou da presença de chaperonas moleculares 5,6,7,8,9. Outra limitação do pulldown convencional é o teste de possível atividade de heteromultimerização entre domínios que podem existir como homooligômeros estáveis montados co-translacionalmente ^8,10, pois muitos deles não conseguem dissociar e reassociar in vitro durante o tempo de incubação. A co-expressão mostrou-se útil na superação de tais problemas ^3,11. A co-expressão usando vetores compatíveis em bactérias foi utilizada com sucesso para purificar grandes complexos macromoleculares multi-subunidades, incluindo o complexo repressivo policomb PRC2¹², o módulo de cabeça mediador da RNA polimerase II¹³, a placa de base do bacteriófago T4 14, o módulo 15,16 da desubiquitinilase do complexo SAGA 15,16 e a ferritina ¹⁷. As origens de replicação comumente usadas para coexpressão são ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ e RSF²⁰. No sistema de expressão Duet comercialmente disponível, essas origens são combinadas com diferentes genes de resistência a antibióticos e convenientes múltiplos locais de clonagem para produzir vetores policistrônicos, permitindo a expressão de até oito proteínas. Essas origens têm diferentes números de cópia e podem ser usadas em combinações variadas para alcançar níveis de expressão equilibrados de proteínas-alvo²¹. Para testar as interações proteína-proteína, várias tags de afinidade são usadas; os mais comuns são 6xHistidina, glutationa-S-transferase (GST) e proteína ligadora de maltose (MBP), cada uma das quais tem uma afinidade específica com a resina correspondente. GST e MBP também aumentam a solubilidade e a estabilidade das proteínas marcadas²².

Vários métodos envolvendo a co-expressão de proteínas em células eucarióticas também foram desenvolvidos, o mais proeminente dos quais é o ensaio híbrido de levedura dupla (Y2H)²³. O ensaio Y2H é barato, fácil e permite o teste de múltiplas interações; no entanto, seu fluxo de trabalho leva mais de 1 semana para ser concluído. Há também alguns ensaios baseados em células de mamíferos menos utilizados, por exemplo, ensaio fluorescente de dois híbridos (F2H)²⁴ e ensaio de interação proteína-proteína de matriz celular (CAPPIA)²⁵. O ensaio F2H é relativamente rápido, permitindo observar interações proteicas em seu ambiente celular nativo, mas envolve o uso de equipamentos de imagem caros. Todos esses métodos têm uma vantagem sobre a expressão procariótica, proporcionando a tradução eucariótica nativa e o ambiente de dobramento; no entanto, eles detectam a interação indiretamente, seja por ativação transcricional ou por transferência de energia fluorescente, que muitas vezes produz artefatos. Além disso, as células eucarióticas podem conter outros parceiros de interação de proteínas de interesse, o que pode interferir no teste de interações binárias entre proteínas de eucariotas superiores.

O presente estudo descreve um método para a co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas seguido de técnicas convencionais de pulldown. O método permite estudar as interações entre proteínas-alvo que requerem co-expressão. É mais eficiente em termos de tempo em comparação com o pulldown tradicional, permitindo o teste em lote de vários alvos, o que o torna vantajoso na maioria dos casos. A co-expressão usando vetores compatíveis é mais conveniente do que a co-expressão policistrônica, uma vez que não requer uma etapa de clonagem trabalhosa.