Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi
Summary
Bu protokol, hiPSC’leri göz alanı kümelerine ayırmanın ve hem yapışkan hem de süspansiyon kültür sistemlerini içeren basitleştirilmiş kültür koşullarını kullanarak nöro-retinal organoidler üretmenin etkili bir yöntemini açıklamaktadır. RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri de retina kültürlerinde olgun göz alanlarından izole edilebilir.
Abstract
Pluripotent kök hücreler, in vitro hastalık modelleme çalışmaları ve rejeneratif tedaviler geliştirmek için yararlı olan karmaşık doku organoidleri üretebilir. Bu protokol, retinal farklılaşmanın ilk 4 haftasında, farklı, kendi kendini organize eden göz alanı primordial kümelerinin (EFP’ler) ortaya çıkmasına kadar, yapışkan tek katmanlı kültürlerden oluşan hibrid bir kültür sisteminde retinal organoidlerin üretilmesinin daha basit, sağlam ve aşamalı bir yöntemini tanımlamaktadır. Ayrıca, her EFP’deki çörek şeklindeki, dairesel ve yarı saydam nöro-retinal adalar, çok katmanlı 3D optik kaplar (OC-1M) üretmek için 1-2 hafta boyunca retinal farklılaşma ortamında yapışkan olmayan kültür kapları kullanılarak süspansiyon altında manuel olarak toplanır ve kültürlenir. Bu olgunlaşmamış retinal organoidler PAX6+ ve ChX10+ proliferasyonlu, multipotent retinal öncülleri içerir. Öncü hücreler organoidler içinde doğrusal olarak kendi kendine monte edilir ve farklı radyal çizikler olarak görünür. Süspansiyon kültüründen 4 hafta sonra, retinal progenitörler post-mitotik arrest ve olgun retinal organoidleri (OC-2M) oluşturmak için soy farklılaşmasına uğrarlar. Fotoreseptör soyu işlenen öncüller, retinal organoidlerin en dış katmanlarında gelişir. Bu CRX + ve RCVRN + fotoreseptör hücreleri, iç segment benzeri uzantıları görüntülemek için morfolojik olarak olgunlaşır. Bu yöntem, insan embriyonik kök hücreleri (hESC’ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC’ler) kullanılarak retinal organoidler üretmek için benimsenebilir. Tüm adımlar ve prosedürler, tekrarlanabilirliği sağlamak ve temel bilim ve çeviri araştırmalarında daha geniş uygulamalar için açıkça açıklanmış ve gösterilmiştir.
Introduction
Retina, omurgalı gözün arkasında bulunan ve ışık sinyallerini foto-transdüksiyon yolu olarak bilinen biyokimyasal bir fenomenle sinir uyarılarına dönüştüren ışığa duyarlı bir dokudur. Retinanın fotoreseptör hücrelerinde üretilen ilk sinir uyarıları, diğer retinal internöronlara ve retinal ganglion hücrelerine (RGC’ler) dönüştürülür ve beynin görsel korteksine ulaşır, bu da görüntü algısına ve görsel tepkiye yardımcı olur.
Dünya Sağlık Örgütü’ne (WHO) göre, 1 milyonu Asya’da olmak üzere tahmini 1,5 milyon çocuk kördür. Kalıtsal Retina Distrofisi (IRD), dünya çapında 4.000 kişiden 1’ini etkileyen majör bir körleme hastalığıdır 1,2,3, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ile ilişkili körlük prevalansı gelişmekte olan ülkelerde %0,6-%1,1 arasında değişmektedir 4. IRD’ler, retina gelişimi ve fonksiyonunda rol oynayan 300’den fazla farklı gendeki kalıtsal genetik kusurlardan kaynaklanır5. Bu tür genetik değişiklikler, normal retina fonksiyonlarının bozulmasına ve retina hücrelerinin, yani fotoreseptör hücrelerin ve retina pigmentli epitelin (RPE) kademeli olarak dejenerasyonuna neden olur ve böylece ciddi görme kaybına ve körlüğe yol açar. Kornea, lens vb. ile ilgili diğer kör edici durumlarda muazzam ilerlemeler kaydedilmiştir. Bununla birlikte, retina distrofileri ve optik sinir atrofilerinin bugüne kadar kanıtlanmış bir tedavisi yoktur. Yetişkin bir insan retinasında kök hücrelerbulunmadığından 6, embriyonik kök hücreler (ESC’ler) ve hasta kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC’ler) gibi alternatif kaynaklar, istenen hücre tiplerinin sınırsız bir tedarikini sağlayabilir ve in vitro hastalık modelleme çalışmaları için gerekli olan karmaşık doku organoidlerinin geliştirilmesi ve rejeneratif tedavilerin geliştirilmesi için büyük bir umut vaat edebilir7, 8,9,10.
Birkaç yıllık retinal araştırma, erken retina gelişimini düzenleyen moleküler olayların daha iyi anlaşılmasını sağlamıştır. PSC’lerden retinal hücreler ve 3D organoidler üretmek için kullanılan protokollerin çoğu, bilinen biyolojik süreçleri aşamalı bir şekilde modüle etmek için hücreleri karmaşık bir büyüme faktörleri ve küçük moleküller kokteylinde kültürleyerek bu gelişimsel olayları in vitro olarak özetlemeyi amaçlamaktadır. Bu şekilde üretilen retinal organoidler başlıca retinal hücrelerden oluşur: retinal ganglion hücreleri (RGC’ler), internöronlar, fotoreseptörler ve retina pigmentli epitel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Retinal organoidleri kullanarak IRD’leri modellemeye yönelik başarılı girişimlere rağmen, farklılaşma sırasında büyüme faktörlerinin ve küçük moleküllerin karmaşık kokteyline olan gereksinim ve retinal organoid üretiminin nispeten düşük verimliliği, çoğu protokolde büyük bir zorluk oluşturmaktadır. Bunlar büyük ölçüde embriyoid cisimlerin oluşumunu ve ardından in vitro gelişimin farklı aşamalarında karmaşık kültür koşullarını kullanarak retinal soylara kademeli olarak farklılaşmalarını içerir20,21,22.
Burada, sağlıklı kontrol ve retina hastalığına özgü hiPSC’lerden kompleks 3D nöro-retinal organoidler geliştirmek için basitleştirilmiş ve sağlam bir yöntem bildirilmiştir. Burada tarif edilen protokol, embriyoid vücut oluşumuna ihtiyaç duymadan yakın birleşimli hiPSC kültürlerinin doğrudan farklılaşmasını kullanır. Ayrıca, kültür ortamının karmaşıklığı basitleştirilmiştir, bu da onu yeni araştırmacılar tarafından kolayca benimsenebilecek uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir teknik haline getirmektedir. Retinal farklılaşmanın ilk 4 haftasında, farklı, kendi kendini organize eden göz alanı ilkel kümelerinin (EFP’ler) ortaya çıkmasına kadar yapışkan tek katmanlı kültürlerden oluşan hibrit bir kültür sistemini içerir. Ayrıca, her EFP içindeki dairesel nöro-retinal adalar, PAX6 + ve CHX10 + prolifere eden nöro-retinal öncüllerden oluşan çok katmanlı 3D retinal kaplar veya organoidler hazırlamak için 1-2 hafta boyunca süspansiyon kültürlerinde manuel olarak toplanır ve yetiştirilir. Retinal organoidlerin 100 μM Taurin içeren ortamda 4 hafta daha uzatılmış kültürü, RCVRN + ve CRX + fotoreseptör öncüllerinin ve ilkel iç segment benzeri uzantılara sahip olgun hücrelerin ortaya çıkmasına neden olmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
hiPSC’ler in vitro organ ve doku gelişimini incelemek için güçlü bir araçtır. Sağlıklı ve hastalığa özgü hiPSC’leri retina soyuna doğru ayırt ederek hastalık fenotipinin özetlenmesi, kalıtsal retina distrofilerinin farklı formlarının patofizyolojisi hakkında daha yeni bilgiler edinilmesine yardımcı olabilir. PSC’lerin retinal hücre tiplerine in vitro farklılaşması için çeşitli protokoller tanımlanmış ve benimsenmiştir. Bunların çoğu, rekombinant büyüme faktörler…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Genetikçi Dr. Chitra Kannabiran’ın bilimsel ve teknik desteğini kabul ediyor; Dr. Subhadra Jalali, Retina Danışmanı; Dr. Milind Naik, Oküloplastik Cerrah; ve Dr. Swathi Kaliki, LV Prasad Göz Enstitüsü, Haydarabad’da Oküler Onkolog normal ve hastaya özgü iPSC hatlarının oluşturulmasına doğru. Yazarlar, Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Bilim ve Teknoloji Bölümü (IM), (SB / SO / HS / 177/2013), Biyoteknoloji Bölümü (IM), (BT / PR32404 / MED / 30/2136/2019) ve ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) ve CSIR (V.K.P.), Hindistan Hükümeti’nden Kıdemli Araştırma Burslarından Ar-Ge hibelerini kabul etmektedir.
Materials
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
Referenzen
- Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
- Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
- . RetNet – Retinal Information Network Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022)
- Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
- Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
- Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
- Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
- Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
- Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
- Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
- Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
