自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

自然免疫系は、感染中および組織損傷や恒常性の変化などの無菌刺激に応答して、最初の防御線として機能します。細胞表面と細胞質にある自然免疫センサーは、病原体または損傷に関連する分子パターン(それぞれPAMPまたはDAMP)に応答し、炎症性シグナル伝達経路と細胞応答を引き起こします。自然免疫応答の重要なプロセスの1つは、感染または損傷した細胞を除去し、さらなる自然免疫応答および適応免疫応答を促進するための細胞死の誘導です。プログラム細胞死(PCD)は、種を超えて高度に保存されたプロセスであり、自然免疫メカニズムとしての進化的重要性を強調しています。

すべての細胞タイプで活性化できるいくつかの自然免疫PCD経路があります。カスパーゼは、高度に保存された細胞内システイン依存性プロテアーゼの重要なファミリーであり、従来の非炎症性アポトーシス経路だけでなく、パイロトーシス、ネクロプトーシス、パンノプトーシスなどの炎症性PCD経路を含む多くのPCD経路で重要です1,2,3,4,5 .明確に定義された11のヒトカスパーゼと10のマウスカスパーゼ、および機能的である可能性のある疑似カスパーゼがあり、ほとんどは、活性化のために切断を必要とする不活性な単量体または二量体のプロカスパーゼとして構成的に発現されます^6,7。カスパーゼには、多タンパク質複合体の動員と形成のための重要なドメインも含まれています。これらには、カスパーゼ-1、カスパーゼ-2、カスパーゼ-4、カスパーゼ-5、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-11に見られるカスパーゼ活性化およびリクルートメントドメイン(CARD)、またはカスパーゼ-8およびカスパーゼ-10に見られるデスエフェクタードメイン(DED)が含まれます。カスパーゼは、タンパク質分解活性と多タンパク質複合体を形成する能力の両方を通じて、自然免疫PCDの重要な推進力です。

自然免疫PCDにおけるカスパーゼの役割は、開始カスパーゼであるカスパーゼ-2、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-10が実行者カスパーゼ、カスパーゼ-3、カスパーゼ-6、およびカスパーゼ-7を活性化して細胞死を引き起こすアポトーシスで最初に確認されました8,9,10,11,12。イニシエーターカスパーゼは、多様なシグナル伝達カスケードによって活性化することができる。外因性経路は細胞外リガンド誘発性死受容体シグナル伝達を介してカスパーゼ-8を活性化し、内因性経路はミトコンドリア完全性の破壊を介してカスパーゼ-9を活性化します¹³。活性化された開始カスパーゼは、実行者カスパーゼの大小の触媒サブユニットを分離するリンカーを切断して、それらの活性型を生成します。次に、死刑執行者のカスパーゼは基質を切断して細胞を分解し、DNA分解、膜ブレッブ、核断片化、およびアポトーシス体の放出をもたらします^14,15。このプロセスは典型的には、エフェロサイトーシスによる死にかけている細胞の即時クリアランスと相まって、非溶解性および非炎症性の細胞死の形態で終わる¹⁶。しかし、エフェロサイトーシスの欠陥または食細胞の欠如は、アポトーシス細胞の蓄積につながる可能性があり、その後、溶解性および炎症性細胞死を経験します^17,18。

カスパーゼ-1(ヒトおよびマウス)、カスパーゼ-4およびカスパーゼ-5(ヒト)、およびカスパーゼ-11(マウス)を含む炎症性カスパーゼは、パイロトーシスと呼ばれる炎症性自然免疫PCD(III-PCD)の形態の間に活性化されることが発見されている。カスパーゼ-1の活性化は、細胞質自然免疫センサー、アダプター分子(CARD[ASC]を含むアポトーシス関連斑点様タンパク質)、およびカスパーゼ-1を含む多タンパク質複合体であるインフラマソームの形成に関連しています。この複合体の形成により、カスパーゼ-1は近接媒介自己タンパク質分解を受けてその活性型を放出し、炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン(IL)-1βおよびIL-18、および孔形成分子ガスダーミンD(GSDMD)を含む標的基質を切断することができます19,20,21,22,23。.カスパーゼ-11、カスパーゼ-4、およびカスパーゼ-5は、リポ多糖(LPS)^19,20などのPAMPを感知した後、インフラマソームの上流形成なしにGSDMDを活性化することもできます。これらのカスパーゼは、細胞質LPSに結合すると、二量体化とそれに続くオリゴマー化および自己切断を受けて活性化され、非標準的なインフラマソーム活性化24,25,26およびカスパーゼ-1活性化を細胞内因性的に誘導してIL-1βおよびIL-18成熟を誘導する²⁰。これらの炎症誘発性サイトカインの成熟と放出は、これらのカスパーゼを「炎症性」として特徴付けます。さらに、アポトーシスカスパーゼ-8はインフラマソームに局在し、アポトーシスプロセスとパイロトーシスプロセスの間のリンクを提供することがわかっています。研究によると、アポトーシスカスパーゼ-8は、ネクロプトーシスと呼ばれる別の形態のPCDを調節するためにも重要であることがわかっています。カスパーゼ-8の喪失は、自発的に受容体相互作用するセリン-スレオニンキナーゼ3(RIPK3)媒介混合系統キナーゼドメイン様シュードキナーゼ(MLKL)活性化をもたらし、ネクロトーシスのIII-PCD経路を駆動します27,28,29,30,31,32,33,34,35。

カスパーゼは歴史的に、カスパーゼが開始する細胞死の種類に基づいて「アポトーシス」または「炎症性」に分類されてきましたが、カスパーゼを介した自然免疫PCD経路の間に広範なクロストークがあることを示唆する証拠が増えています^3,4。例えば、インフラマソーム由来の炎症性カスパーゼ−1は、その標準的な活性化部位³⁴でアポトーシスカスパーゼ−7を切断する。カスパーゼ-1の活性化は、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1(PARP1)³⁶などのアポトーシス基質の切断にもつながります。GSDMDを欠く細胞では、カスパーゼ-1はカスパーゼ-3を切断することもできる^37,38。さらに、標準的にアポトーシスカスパーゼ-3は、ガスデルミンE(GSDME)を切断してPCD^17,18を誘導し、GSDMDを不活性型⁴⁰に処理することもできます。さらに、インフラマソーム複合体へのカスパーゼ-8の動員が観察されており39、40、41、^42、43、^44、45、およびカスパーゼ-8は^、標準的および非標準的なインフラマソーム活性化の重要な調節因子である³⁹。また、多くの炎症状態においてカスパーゼ-8およびカスパーゼ-1には重複した冗長な役割があり、パイロトーシス、アポトーシス、およびネクロトーシス成分の活性化を特徴とする自然免疫PCDは、疾患スペクトル全体で発生します³⁹、46、⁴⁷、⁴⁸、^49、50。

炎症性カスパーゼとアポトーシスカスパーゼのクロストークに基づいて、自然免疫とPCDの機構的理解における重要なギャップが特定され、PANoptosisの発見につながりました。PANoptosisは、病原体、PAMP、DAMP、および恒常性の変化に応答して活性化され、他の細胞死経路からの成分を統合する多面的な高分子複合体であるPANoptosomesによって制御されるIII-PCDのユニークな形態です44,50,51,52,53,54,55.PANoptosisの生物学的効果の全体は、パイロトーシス、アポトーシス、またはネクロトーシスだけでは個別に説明できません3,4,35,36,39,46,47,48、PANoptosisは、カスパーゼ-1、カスパーゼ-11、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、カスパーゼ-3、および/またはカスパーゼ-7を含む複数のカスパーゼの活性化によって特徴付けられるためです。コンテキストに応じて44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 .PANoptosisは、感染症や炎症性疾患、癌やがん治療にますます関与しています3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 、^54、56
、57,58,59,60,61,62,63,64,65,66。

アポトーシス、パイロトーシス、ネクロプトーシス、パンノプトーシスなど、細胞死経路全体でカスパーゼが果たす重要な役割を考えると、それらの活性化を特徴付け、PCD経路の完全な複雑さを理解するための技術を開発することが重要です。ここでのプロトコルは、細胞を刺激し、その後のカスパーゼの活性化を測定する方法を詳述しています(図1)。この方法は、カスパーゼの活性化に一般的に必要とされるカスパーゼのタンパク質分解切断を、カスパーゼの研究手段として活用しています。ウェスタンブロッティングにより、タンパク質サイズを決定できるため、不活性なプロカスパーゼとその活性化された切断型を明確に可視化して区別することができます。

このプロトコルの主な利点は、1)内因性細胞の単一集団から複数のカスパーゼの活性化を並行して評価して、PCD活性化をより正確に決定できること、および2)広範なトレーニングや高価な機器を必要としない比較的単純なラボ技術の使用です。これまでのプロトコルでは、ウェスタンブロッティング、蛍光レポーター、または抗体染色を使用して、培養上清、細胞および組織溶解物、全細胞中のカスパーゼ活性化を顕微鏡検査、およびin vivo^{でモニターしていました67}、^68、69、⁷⁰、⁷¹ですが、これらの手法は通常^、サンプル中の1つまたは2つのカスパーゼのみをモニターします。さらに、切断時に蛍光を発するカスパーゼ切断部位を含む合成ペプチド基質が、細胞または組織ライセート⁶⁹におけるカスパーゼ活性化をモニターするために使用されてきたが、これらの基質はしばしば複数のカスパーゼによって切断される可能性があり、この系における個々のカスパーゼの特異的活性化を決定することは困難である。さらに、蛍光レポーターや他のタグベースの方法を使用するのではなく、ウェスタンブロッティングを使用することで、研究者はレポーター遺伝子を持つ特定の細胞株を作成するのではなく、内因性細胞を使用することができます。内因性細胞を使用することには、多くの不死化細胞株が重要な細胞死分子^72,73が不足しているという事実を含む複数の利点があり、結果に影響を与える可能性があります。さらに、内因性細胞を使用することで、単一の系統ではなく、マクロファージ、上皮細胞、内皮細胞などの多様な細胞タイプの評価が可能になります。ウェスタンブロッティングは比較的シンプルで費用対効果の高い手法でもあり、大型で高価な装置や複雑なセットアップを必要とせずに、世界中のラボで実施できます。

このプロトコルは、カスパーゼの細胞死依存性および細胞死非依存性機能の両方を理解するために、他の炎症性シグナル伝達経路におけるそれらの足場の役割および機能を含む、生物学全体に広く適用可能である⁷⁴。この方法を適用することで、自然免疫PCD経路と疾患および状態全体の炎症シグナル伝達の研究における統一されたアプローチが可能になり、このプロトコルを使用して、将来の治療戦略の開発に情報を提供する重要な調節プロセスと機構的接続を特定できます。