Kombinere clearing og fluorescensmikroskopi for å visualisere endringer i genuttrykk og fysiologiske responser på Plasmodiophora brassicae

Planter påvirket av patogener eller insekter kan utvikle unormale strukturer (organdeformasjoner eller galler), som tillater inntrengeren å innta næringsstoffer og reprodusere¹. Her ble det gjennomført en effektiv histopatologisk tilnærming for å studere endringene som foregår i galler som utvikler seg på de underjordiske delene av planter infisert med protisten Plasmodiophora brassicae (figur 1). Den mindre tråden forbundet med dette patogenet kommer fra det faktum at P. brassicae hvilesporer kan beholde sin evne til å invadere planter i mange år. Ved storskala dyrking av oljefrøraps (Brassica napus) er dette et alvorlig problem siden økonomiske faktorer begrenser vekslingen, noe som fører til hvilesporeakkumulering i jorda². Oljefrørapsens motstand mot klubbrotsykdom forårsaket av P. brassicae er genetisk bestemt. Dessverre overlister patogenet ofte motstand på grunn av sin biologi og det smale genetiske bassenget som oljefrøraps stammer fra. Derfor har det blitt relevant å studere responsene etter infeksjon hos vertsplanter og deres evne til å bremse sykdomsprogresjonen eller forhindre at visse symptomer utvikler seg.

I clubroot sykdom vurderes alvorlighetsgraden generelt basert på utviklingen av galls og graden av rotsystemskade. Dette er kjent som sykdomsindeksen-DI³. Det fanger imidlertid ikke fullt ut den sanne vurderingen av denne plantepatogeninteraksjonen. Spesielt tar det ikke opp hvordan patogenet fordeles i røttene, og om planten kan begrense seg. P. brassicae bevegelse i vevet. Videre er det ikke lett å forutse i hvilken grad P. brassicae omprogrammerer underjordisk orgelanatomi. Studier på modellanlegget Arabidopsis thaliana har vist at P. brassicae infeksjon fører til hemming av xylogenese (både initierings- og modningstrinn) og forbedring av floemdifferensiering i galler^4,5. Videre, i røtter og hypokotyler av infiserte planter, slutter ikke cambial celle avkom mitotisk tilstand og sprer seg lenger enn i sunne planter.⁶. Denne prosessen styrer den endelige størrelsen på gallen og bestemmer antall patogen hvilesporer produsert i den infiserte planten. P. brassicae-drevet utviklingsmessig, metabolsk og fysiologisk omprogrammering i verten er svært kompleks⁷; Derfor er anvendelsen av verktøy som tillater inspeksjon av interne endringer i Galls avgjørende for riktig vurdering av denne interaksjonen. Livssyklusprogresjonen til P. brassicae er ledsaget av omprogrammering av vertscellemetabolismen, som kan observeres som stivelse eller lipidavsetning^7,8. Hovedhindringen for vellykket mikroskopi av galls kommer fra deres lave gjennomsiktighet. På grunn av dette stammer flertallet av histologiske prøver som presenterer klubbrotdrevne endringer innen galler fra fikseringsinnlemming (voks eller harpiks) teknikker etterfulgt av mikrotomseksjonering. Slike tilnærminger ble vellykket brukt til å lokalisere promotoraktiviteten for mange gener som er aktive i klubbrotgaller.^4,5 eller ulike fargeteknikker som letter observasjonen av P. brassicae Progresjon i livssyklusen⁹. Det må imidlertid bemerkes at fikserings- og innebyggingstrinnene er tidkrevende og resulterer i delvis eller fullstendig utvasking av viktige biomolekyler (f.eks. Lipider), noe som betydelig hindrer visse observasjoner. Nylig P. brassicae livssyklusprogresjon i verten ble visualisert ved hjelp av fluorescerende In Situ Hybridization (FISH), der en SABATH-type metyltransferase (PbBSMT) genspesifikk sonde ble brukt for å markere hvilesporedannelse¹⁰. Et godt alternativ er bruk av andre fluorescensbaserte metoder der autofluorescensen til noen cellulære komponenter, aktiviteten til 5'- oppstrøms regulatoriske regioner av gener smeltet sammen med fluorescerende proteinmarkører, og akkumulering av bestemte fluorescerende merkede proteiner kan sees. I tillegg til prøvenes lave gjennomsiktighet arbeider imidlertid en stor ulempe forbundet med slike objekter med ufikserte prøver, noe som reduserer tiden der bilder av god kvalitet kan dokumenteres. I 2015, Kurihara et al.¹¹ utviklet et clearingreagens, som tillater bevaring av fluorescerende proteiner og øker gjennomsiktigheten av plantevevsprøver. I tillegg er den kompatibel med mange histologiske flekker. Nylig ble den samme teknikken vellykket brukt for å visualisere forskjellige celleveggkomponenter i plantevev.^12,13. Her har denne protokollen blitt brukt til å analysere ulike clubroot gall utviklingsaspekter. Arbeidsflyten begynner med fiksering av galler, vibratomseksjonering, vevsrydding, farging og fluorescensbilder. Avhengig av ens behov, direkte eller etter spesiell farging, kan de resulterende delene bli utsatt for inspeksjon under en epifluorescens eller konfokalt mikroskop. Denne metoden gir en effektiv løsning for å studere lokale endringer i genuttrykk og fysiologiske responser, inkludert fytohormonbalanse og signalering. Sykdomsprogresjon kan spores ved å se på distribusjonsmønsteret til hvilesporer og modningsdynamikk. Videre kan protokollen enkelt brukes til å avbilde karakteristiske endringer innen P. brassicae infiserte planter, inkludert hemming av xylogenese eller vertsplanteforsvarsresponser synlig som lokal lignifisering i resistente genotyper. Eksempler i denne protokollen kommer fra bildebehandling utført på Arabidopsis thaliana modell; Protokollen kan imidlertid også anvendes på andre avlingsarter som tilhører Brassicaceae familie. Metoden beskrevet nedenfor vil legge til rette for fremtidige detaljerte studier av cellulære strukturer og molekylære endringer som følger med galledannelse i P. brassicae-infiserte planter.

Den generelle arbeidsflyten til protokollen er ganske grei, og alle stadier av gallutvikling kan enkelt avbildes og karakteriseres (figur 2). Siden P. brassicae er et jordbårent patogen, må alle eksperimenter utføres i jordbaserte systemer. Patogenet foretrekker sure forhold; Derfor må ikke-kalkbehandlede jordsubstrater brukes. Selv om P. brassicae ikke utgjør en trussel mot mennesker, er det strengt tatt et plantepatogen som kan spre seg gjennom jord og vann. Derfor må alle deler av den infiserte planten, så vel som jorda, ødelegges etter forsøket ved autoklavering eller ved behandling med blekemiddel.

1. Plantevekstforhold

1. Dyrk Arabidopsis thaliana-planter i et kortdagslysregime med 9 timers lys ved 22 °C og 15 timer mørkt ved 20 °C og en bestråling på 120 μmol·m−²s⁻¹ (målt som fotosyntetisk aktiv stråling, PAR på baldakinnivå, se materialtabell).

2. Tilberedning av spore inokulum

MERK: For detaljer, se Fuchs et ^al.14.

1. Homogeniser to til tre frosne galler fra kinesiske kålplanter (Brassica rapa var. pekinensis cultivar "Granaat") i en blender som inneholder 300 ml autoklavert destillert vann og filtrer gjennom fire lag sterilt gasbind.
2. Sentrifuge filtratet (ved 6000 x g, i 5 minutter og ved 4 °C) og mekanisk fjerne stivelseslaget fra sporepelletsen ved hjelp av en slikkepott. Gjenta denne prosessen til det meste av stivelsen er fjernet.
3. Bestem sporekonsentrasjonen ved hjelp av et hemocytometer¹³ ved å telle antall sporer i 20 forskjellige feltområder.
4. Sørg for at den endelige konsentrasjonen av sporesuspensjon som brukes til inokulering er 1 x 10⁶ sporer·ml⁻¹ for Arabidopsis thaliana. Inokuler hver plante 20 dager etter spiring med 2 ml kalibrert sporesuspensjon.

3. Vevsforberedelse og fiksering

1. Forbered plantevevet.
   1. Fjern forsiktig jord fra rotsystemene til klubbrotinfiserte og ikke-infiserte planter. Rengjør grundig med vann og samle hypokotyler og galler (lengde mellom 0,5-2 cm) i mikrosentrifugerør.
2. Utfør PFA-fiksering (4% paraformaldehyd, PFA i 1x PBS + 0,01% Triton X-100) ved å følge trinnene nedenfor.
   1. Tilsett 4 g PFA-pulver (se materialfortegnelse) til 100 ml PBS (fosfatbufret saltvann, pH 7,4, tabell 1) ved omrøring ved 65 °C (ikke koke). Bruk KOH (10 M og 1M) dråpevis for å oppnå en klar oppløsning med en pH på rundt 11.
   2. Juster pH med H₂SO₄ for å få den ned til 6,9 og tilsett 0,01 % (v/v) Triton X-100 for å forbedre fikseringen. Aliquot oppløsningen for lagring ved −20 °C (ikke frys på nytt) eller oppbevares ved 4 °C.
3. Utfør vevsfiksering.
   1. Fest prøvene i 200-500 μL PFA-fiksativ i 1 time ved romtemperatur ved å påføre et konstant vakuum (700 mbar) ved hjelp av en vakuumpumpe. Forsikre deg om at objektet er helt nedsenket i PFA-løsningen.
      MERK: Prøvene kan lagres i noen uker ved 4 °C (kjøleskap) og brukes senere til seksjonering.

4. Vevsinnbygging og seksjonering

1. Bruk 4% w / v agarose for agarose embedding av ikke-infiserte hypokotyler og infiserte galls. Kok løsningen for å oppløse agarose og hell den når den avkjøles mens den fortsatt er tyktflytende.
2. Tørk objektet litt på et vev i noen sekunder for å fjerne overflødig PFA.
3. Bruk tannpirkere/tang til å forsiktig legge inn og orientere planteobjektet i agarose. For å forhindre skrå seksjoner, sørg for at objektet er orientert og støpt riktig slik at aksen er vinkelrett på vibratomebladets plan (for radiale seksjoner).
4. For å akselerere agarosestørkning, plasser Petri- eller flerkulturplaten ved 4 °C i 10 minutter.
   MERK: Hvis objektet er for stort (som i tilfelle av større galls av Arabidopsis 21 dager etter inokulering [DPI]), kan objektet seksjoneres selv uten å legge inn i agarose.

5. Vibratome seksjonering

MERK: Vibratomen er utstyrt med et vibrerende barberblad for å skjære gjennom planteorganer / vev. Vibrasjonshastigheten, amplituden, vinkelen på bladet og seksjonstykkelsen er alle parametere som kan justeres (se materialfortegnelse).

1. Bruk et blad, kutt forsiktig og form gjenstanden i en agaroseblokk, og legg merke til den foretrukne retningen for seksjonering.
2. Fest agaroseblokken/den store gallen for å montere den ordentlig på prøveholderen ved hjelp av cyanoakrylat/øyeblikkelig lim og maskeringstape (se Materialfortegnelse).
3. For Arabidopsis hypokotyler og galls (tidlige stadier), hold tykkelsen på seksjoner mellom 30-40 μm for å oppnå bilder av god kvalitet.
   MERK: For å analysere de senere stadiene av gallprogresjon, kan tykkelsen på seksjonene være mellom 50-80 μm.
4. Avstå fra å kutte tynnere seksjoner, da det kan ødelegge galleprøven på grunn av vibrasjonene i det bevegelige bladet.
5. Juster tykkelsen for seksjoner, hastighet og vibrasjonsamplitude i henhold til gallens tykkelse og størrelse (40 μm eller 60 μm).
6. Tilsett destillert vann i vannbadet og begynn med seksjonering.
7. Samle forsiktig seksjoner ved hjelp av tang eller børste og overfør dem til et mikrosentrifugerør som inneholder 1 ml 1x PBS-buffer (pH 7,4).
   MERK: Vanligvis, jo høyere vibrasjonsamplitude, jo bedre seksjoneringskvalitet. For ikke-infiserte hypokotyler eller galler som ikke inneholder modne hvilesporer, kan vibrasjonsamplitude holdes på 1,2 mm med 0,60 mm · ^s-1 hastighet. Ved store galler med delvis tap av cellulær integritet og synlige tegn på sporemodning, bør vibrasjonsamplitude reduseres til 0,55 mm med 0,45 mm^·s−1 hastighet.

6. Rydding av prøver

1. Fjern 1x PBS fra mikrosentrifugerøret og tilsett 200-500 μL clearingløsning (tabell 1).
2. Fra nå av lagrer du prøvene ved romtemperatur i mørket. Sørg for at objektene alltid er nedsenket i ryddeløsningen til enhver tid.
3. Erstatt ryddeløsningen med den nye hvis fargen endres etter en tid under prøvebehandlingen.
   MERK: Fargen på clearingløsningen kan bli gulaktig på grunn av prøvebehandling. I et slikt tilfelle anbefales det å erstatte løsningen for å forbedre ryddingen av vev.

7. Farging prosedyre

1. For kalkofluorhvit farging for celleveggene (for utlegging av planteceller), klargjør 5 % v/v kalkofluorhvit flekk (se materialfortegnelse) i ryddeløsningen. Flekk i minst 5 minutter i mørket.
2. For farging av lipider med Nile Red (for farging av hvilesporer og oljedråper i infiserte celler), tilbered 1 mg/ml av stamløsningen (se materialfortegnelse) i ryddeløsning. Fortynn den ytterligere for å oppnå 1:99. Flekk i minst 10 minutter i mørket.
3. For grunnleggende Fuchsin ligninfarging, klargjør 0,2 % w/v av beisen (se materialfortegnelse) i ryddeløsning. Flekk i minst 10 minutter i mørket.
   MERK: Under dobbeltfarging blir prøvene først farget med Nile Red i 10 minutter før Calcofluor hvit påføring. De overflødige fargeløsningene ble fjernet etter hvert trinn. Hvis gjenstanden virker overfarget, fjern overflødig flekk ved å vaske med ryddeløsningen. Fortynn flekker ved hjelp av ryddeløsningen, om nødvendig. Flekk alltid prøven med Nile Red / Basic Fuchsin før Calcofluor farging. Farging først med Calcofluor kan forhindre riktig farging av sporene av Nile Red.

8. Mikroskopi

1. Monter ryddede seksjoner på mikroskopiskopi-lysbildet og observer under en epifluorescens eller et konfokalt mikroskop (se Materialtabell). Bruk ryddeløsning som monteringsmedium for å forhindre tørking av prøven.
2. Bruk flere innsamlingsmoduser for å avbilde mer enn ett fluorescensspekter samtidig.
   MERK: Eksitasjons-/utslippsspektrene som brukes i den presenterte protokollen er som følger: for Nile Red 553/636 nm, for xylem autofluorescens 380/475 nm, for Basic Fuchsin 561/650 nm, for Calcofluor white 405/475 nm, for erRFP 585/608 nm, og for GFP 488/509 nm (tabell 2).

Med Nile Red som flekker lipider og suberin, er det mulig å se patogenet hvilesporer som inneholder lipider (figur 3A, B). Derfor, ved hjelp av dobbeltfarging, kan skarpe bilder oppnås for å se på mønsteret av patogenfordeling i gallene. Utjevning med Calcofluor white skaper kontrast og bidrar samtidig til å spore xylemutvikling med P. brassicae-modning (figur 3B).

Dannelse og utvikling av Xylem kan også kontrolleres ved å observere autofluorescens i ufargede prøver (figur 4A) eller ved å bruke flekker som Basic Fuchsin som muliggjør fluorescensbasert avbildning av lignin (figur 4B).

Ved å bruke denne metoden kan man spore genuttrykksendringer eller responser på vekstregulatorer. Et perfekt eksempel er der Arabidopsis-planter som har pHCA2: erRFP-konstruksjon ble brukt til å visualisere HIGH CAMBIAL ACTIVITY 2 (HCA2) genuttrykk i floemvev i klubbrotgaller. HCA2-genaktivitet er tidligere funnet i meristematisk aktive kambium- og floemlinjeceller¹⁵. Her samlokaliseres det med floem i de sene stadiene av P. brassicae-drevet galleutvikling, og aktiviteten gjenspeiler hvordan P. brassicae øker floemkompleksiteten (figur 5). Det resulterende bildet viser floemproliferasjon på sent stadium av galleutvikling når kambium blir fragmentert. Figur 5A viser en uklarert håndseksjon av gallen, mens figur 5B viser mer skarpe og lokaliserte fluorescerende signaler oppnådd ved vibratomseksjonering etterfulgt av vevsrydding. Gjenstandene ble motsto med Calcofluor hvit. Figur 6 sammenligner dette bildet (figur 6B) med en lignende region avbildet i harpiks-innebygd og mikrotom-seksjonert galls (figur 6A) ved 21 DPI. Differensielle cytokininresponser mellom infiserte og ikke-infiserte planter ble vurdert ved å kontrollere uttrykket av TCS:GFP (Two Component Signalling) markør¹⁶ i utvikling av galler (figur 7). Mens du avbilder svake GFP-signaler i galls og vev med sekundære fortykninger, er det viktig å merke seg at ytterligere bakgrunnssignal på grunn av autofluorescens av modne xylemceller også fanges opp under avbildning.

Figur 1: Symptomer på clubrootsykdom på oljeraps (B. napus) og Arabidopsis thaliana (Columbia-0) ved 26 DPI med Plasmodiophora brassicae sporer. I løpet av sykdommen utvikler store galls på hele rotsystemet, noe som gjør det ekstremt sprøtt. Den konkluderer med å slippe sporer ut i den omkringliggende jorden for å fremme fremtidige infeksjoner. De øvre delene av plantekroppen viser også tegn på dårlig vekst og utvikling. Til slutt bukker de infiserte plantene under for de ødeleggende effektene på vekstmetabolisme og utvikling når rotsystemet blir fullstendig skadet og planten ikke lenger kan takle sykdommen. Skalalinjen representerer 1 cm. -INF står for mock-inokulert, mens +INF står for P. brassicae-inokulerte planter. Ved denne anledningen er det gitt et bilde av oljefrørapsplanter før jordfjerningen for å presentere sunne rotsystemer. Etter vask samles bare hypokotyl og øvre del av roten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Den generelle arbeidsflyten. Vasket Arabidopsis rotsystemer er (A) dissekert, (B) fast, (C) agarose innebygd, (D) montert og (E) seksjonert på vibratomet. De resulterende gjenstandene blir utsatt for vevsrydding (3 dager til flere uker ved RT i mørket, avhengig av vevstype og tykkelse). (F) Ryddede gjenstander kan deretter farges og inspiseres under mikroskopet. (G) Sammendrag av arbeidsflyten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Merking av patogensporer med Nile Red-flekk. (A,B) Nile Red flekker lipider i hvilesporer, som fungerer perfekt for å spore P. brassicae modning. (A) Forstørrede celler kolonisert av P. brassicae og fylt med patogensporer. (B) Eldre xylemceller blir også farget av Nilen Red. Seksjonen har blitt motsto med Calcofluor white for å se utlegget av vertsceller (A: Objektivlinse = 20x og seksjonstykkelse = 60 μm; B: Objektivlinse = 5x og seksjonstykkelse = 60 μm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Sporing av omfanget av xylemutvikling og modning. (A) Lignin gir sterk autofluorescens ved eksitasjon med UV; Derfor kan moden Xylem diskrimineres relativt enkelt. (B) Dobbel farging med Basic Fuchsin og Calcofluor gir bedre resultater siden alle celler blir farget av sistnevnte fargestoff, mens moden xylem er tydelig farget med Basic Fuchsin. På denne måten gir dobbel farging bilder med forbedret kontrast som viser merkbar inhibering av xylogenese (A: Objektiv linse = 10x og seksjonstykkelse = 60 μm; B: Objektivlinse = 10x og seksjonstykkelse = 60 μm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: Phloem-spesifikt signal for HCA2-genet i hypokotyler av P. brassicae-infiserte planter ved 21 DPI. Promotoraktivitet for proHCA2:: erRFP som inneholder transgen Arabidopsis thaliana kan ses i (A) og (B). Forskjeller kan observeres mellom en ikke-klarert håndseksjon i panel (A) der erRFP-signalet virker diffust på grunn av overlagring og overlappende cellelag, spesielt i ujevne håndseksjoner. På den annen side viser (B) en vibratomseksjon etter vevsrydding der erRFP-signalet nøyaktig markerer floemcellene i en moden vaskulær bunt (Objektiv linse = 20x og seksjonstykkelse = 60 μm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: Sammenligning mellom TB, harpiks-innebygd og mikrotom-seksjonert galls ved hjelp av fluorescens. (A) En sammenligning mellom bilder av Toluidine Blue (TB), harpiks-innebygd og mikrotom-seksjonert galls, og (B) et representativt objekt (også presentert i figur 5B) ervervet ved hjelp av fluorescens. Xylem-celler er merket med gule stjerner, det cambiale området med levende grønne parenteser, floem med cyanstjerner og Plasmodiophora brassicae-koloniserte celler med et hvitt PB-symbol. Harpiks-innebygde seksjoner (A) gir en god oppløsning for å studere fordelingen av hvilesporer i hypertrofierte organer, grad av sykdomsprogresjon og andre prosesser som lokal lignifisering i resistente planter. Protokollen beskrevet her (B) muliggjør imidlertid sensitiv observasjon av genuttrykk eller proteinakkumulering og visualisering av andre fysiologiske endringer og viktige molekyler som lipider (i sporer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7: Sporing av cytokininsignalresponser i hypokotyler av ikke-infiserte (-INF) og P. brassicae-infiserte (+INF) Arabidopsis-planter ved 16 DPI. TCS::GFP-markør ble brukt til å karakterisere i planta cytokininresponser. Vibratomseksjoner ble utsatt for clearingbehandling etterfulgt av farging med Calcofluor white. Basert på bildet, ved 16 DPI, synes cytokininresponser i stor grad å være redusert i infiserte galler (høyre panel), mens de forblir sterke, spesielt i floembassenget (celler som til slutt vil differensiere for å danne floemvev), i ikke-infiserte planter (venstre panel) (Objektiv linse = 5x og tykkelse = 30 μm). Visse nivåer av xylem-autofluorescens kan også være synlige. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Sammensetning av clearingløsningen og fosfatbufret saltvann (PBS).

Tabell 2: Eksitasjons-/emisjonsspektra valgt for denne studien.

Påføring av clearingløsningen på vibratomkuttede deler av galler forbedrer sikkert evnen til å studere det biotrofiske samspillet mellom P. brassicae og vertsplanten. Selv om clearingprotokollen gjelder selv for håndseksjoner, fungerer den bedre med vibratomseksjoner. Fikseringsprøver i PFA-fikseringsmiddel fungerer som et kritisk trinn i protokollen, da prøver deretter kan lagres ved 4 °C i noen dager før de fortsetter med seksjonering. Dette gir fleksibilitet til å lagre prøver i en begrenset periode uten at det går ut over uttrykket og bevaringen av fluorescerende proteiner under fiksering.

Nile Red (i DMSO eller metanol) er uforenlig med harpiksseksjoner på grunn av dets hydrofobisitet, som oppløser harpiks og ødelegger harpiksinnstøpte seksjoner¹⁷. Dermed viser vibratomeseksjoner seg å være medvirkende til å studere patogenfordelingen og dens livssyklus i utviklende galler, hvor Nile Red-farging lett kan brukes.

Clearingløsningen som brukes i denne protokollen er svært allsidig¹², slik at en rekke fluorescensflekker kan brukes i forskjellige kombinasjoner for å flekke forskjellige biomolekyler / komponenter i celleveggene (suberin, lignin, cellulose og kitin i soppinteraksjoner). Det er også mulig å motvirke deler av fluorescerende GFP-markørlinjer og derved korrelere promotoraktiviteten eller proteinakkumuleringsmønsteret med tilstedeværelsen av patogenet i bestemte celler eller regioner i gallen. Imidlertid kunne bakgrunnsautofluorescens fra xylem og patogenfylte gigantiske celler ikke elimineres selv etter clearingprotokollen. Dette gir en begrensning for å se på fluorescerende markører i de senere stadiene av galldannelse, spesielt når du bruker et epifluorescensmikroskop og avbilder svake signaler.

På grunn av de lave nivåene av ekspresjon/akkumulering av fluorescerende signaler er transkripsjonsfaktorer vanskelige å oppdage, men med denne teknikken er det mulig å oppnå tilfredsstillende bilder for dem. Samlet sett utvider kombinasjonen av vibratomseksjonering med vevsryddingsmetoden verktøysettet for histologiske observasjoner av komplekse gallevev. Fleksibiliteten til denne protokollen letter prosessen med vevfiksering og reduserer tiden som kreves for kutting og avbildning av ferske vevsprøver for å observere fluorescerende proteiner og promotoraktiviteter. Med ytterligere forbedringer og ved å bruke andre fluorescerende fargestoffer som er spesifikke for forskjellige biomolekyler, vil denne metoden markere større fremskritt i histologiske studier og bildeanalyse av tette, ugjennomsiktige vev med kompleks vevsorganisasjon. I nyere tid har den presenterte vevsryddingsmetoden dukket opp som en populær og mye brukt protokoll for å kombinere og muliggjøre samtidig oppkjøp av forskjellige fluorescerende signaler^11,12,13. Fremtidig utvikling og modifikasjoner i slike teknikker vil i stor grad forbedre bildeoppløsningen for å observere plantepatogeninteraksjoner på mobilnivå.