Diffusion et assemblage d’une molécule unique sur des membranes lipidiques encombrées de polymères

Les membranes cellulaires sont des systèmes complexes et très encombrés¹. L’encombrement moléculaire peut avoir un impact considérable sur la diffusion d’entités liées à la membrane comme les protéines et les lipides ^2,3,4. De même, les réactions bimoléculaires sur les membranes lipidiques comme la dimérisation des récepteurs ou l’oligomérisation des complexes membranaires sont influencées par l’encombrement ^5,6,7. La nature, la configuration et la concentration des crowders peuvent régir la liaison membranaire, la diffusivité et l’interaction protéine-protéine de plusieurs façons ^8,9. Étant donné qu’il est difficile de contrôler l’encombrement des membranes cellulaires et d’interpréter son influence sur les biomolécules intégrées, les chercheurs ont tenté d’établir d’autres systèmes in vitro ¹⁰.

Une approche populaire pour les membranes artificielles encombrées consiste à doper les membranes bicouches avec des lipides greffés de polymère (tels que le polyéthylène glycol, PEG)^11,12. Au cours de la visualisation de la dynamique des protéines et des lipides sur les bicouches lipidiques soutenues (SLB), ces polymères protègent en outre les composants intégrés à la membrane du substrat sous-jacent chargé négativement (tel que le verre) en soulevant efficacement la bicouche loin du support sous-jacent. En faisant varier la taille et la concentration du polymère, on peut contrôler l’étendue de l’encombrement moléculaire, ainsi que sa séparation du support solide sous-jacent^13,14. C’est clairement un avantage par rapport aux bicouches lipidiques supportées sur des substrats solides sans coussins polymères^15,16, où les biomolécules transmembranaires peuvent perdre leur activité^17,18,19. Plus important encore, cela nous permet de récapituler l’environnement encombré de la membrane cellulaire in vitro, ce qui est essentiel pour de nombreux processus membranaires.

Les polymères greffés en surface sur membranes subissent également des modifications de leur configuration en fonction de leur densité de greffage¹². À de faibles concentrations, ils restent dans une configuration enroulée enroulée, connue sous le nom de champignon, au-dessus de la surface de la membrane. Avec l’augmentation de la concentration, ils commencent à interagir et ont tendance à se dérouler et à s’étendre, donnant finalement une formation dense en forme de brosse sur la membrane²¹. Étant donné que la transition du champignon au régime en brosse est très hétérogène et se manifeste dans des conditions mal caractérisées du polymère, il est important d’utiliser des conditions bien caractérisées pour l’encombrement sur les membranes greffées en polymère. Par rapport à une étude récente²⁰, nous identifions et rapportons des compositions membranaires encombrées qui maintiennent le transport diffusif et l’activité des biomolécules transmembranaires.

Dans ce protocole, nous discutons de la façon de générer des membranes lipidiques PEGylées et fournissons des recommandations pour les densités de PEG qui imitent l’encombrement dans deux régimes différents de configuration de polymère (à savoir, champignon et brosse). Le protocole décrit également la liaison à une seule molécule, le suivi des particules et l’acquisition et l’analyse de données de photoblanchiment pour les molécules intégrées dans ces membranes encombrées. Tout d’abord, nous décrivons les étapes de nettoyage en profondeur, l’assemblage de la chambre d’imagerie et la génération de PEG-SLB. Deuxièmement, nous fournissons des détails pour les expériences de liaison à une seule molécule, de suivi des particules et de photoblanchiment. Troisièmement, nous discutons i) de l’extraction des affinités de liaison relatives, ii) de la caractérisation de la diffusion moléculaire et iii) du comptage des sous-unités dans un assemblage protéique à partir de films de molécules uniques sur la membrane.

Bien que nous ayons caractérisé ce système avec l’imagerie à molécule unique, le protocole est utile pour tous les biophysiciens membranaires intéressés à comprendre l’effet de l’encombrement sur les réactions biomoléculaires sur les membranes lipidiques. Dans l’ensemble, nous présentons un pipeline robuste pour la fabrication de bicouches lipidiques encombrées et soutenues, ainsi que divers tests à molécule unique menés sur eux et les routines d’analyse correspondantes.