Summary

视网膜组织中免疫染色半胱天冬酶-9的定量

Published: July 25, 2022
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Summary

这里介绍详细的免疫组织化学方案,用于鉴定、验证和靶向复杂组织中功能相关的半胱天冬酶。

Abstract

已知半胱天冬酶家族介导细胞死亡以外的许多细胞途径,包括细胞分化、轴突寻路和增殖。自从鉴定细胞死亡蛋白酶家族以来,一直在寻找工具来识别和扩展特定家族成员在发育、健康和疾病状态下的功能。然而,目前广泛使用的许多市售半胱天冬酶工具并非特定于靶向半胱天冬酶。在本报告中,我们描述了我们用于识别,验证和靶向神经系统中caspase-9的方法,该方法使用新型抑制剂和具有免疫组织化学读数的遗传方法。具体来说,我们使用视网膜神经元组织作为模型来识别和验证半胱天冬酶的存在和功能。该方法能够询问细胞类型特异性凋亡和非凋亡半胱天冬酶-9功能,并且可以应用于其他感兴趣的复杂组织和半胱天冬酶。了解半胱天冬酶的功能有助于扩展当前细胞生物学的知识,并且由于它们参与疾病,也有利于确定潜在的治疗靶点。

Introduction

半胱天冬酶是调节疾病12中发育细胞死亡,免疫反应和异常细胞死亡的蛋白酶家族。虽然众所周知,半胱天冬酶家族的成员在各种神经退行性疾病中被诱导,但了解哪种半胱天冬酶驱动疾病病理学更具挑战性3。此类研究需要工具来识别、表征和验证单个半胱天冬酶家族成员的功能。从机制和治疗的角度来看,解析相关的个体半胱天冬酶都很重要,因为文献中有多项研究提供了半胱天冬酶不同作用的证据45。因此,如果目标是针对疾病中的半胱天冬酶以获得治疗益处,那么针对相关家庭成员的特定目标至关重要。检测组织中半胱天冬酶水平的传统技术包括蛋白质印迹和酶法和荧光法36。然而,这些措施都不允许对半胱天冬酶水平进行细胞特异性检测,在某些情况下,裂解的半胱天冬酶通常无法通过传统的蛋白质分析措施检测到。众所周知,半胱天冬酶可以在同一组织中发挥不同的凋亡和非凋亡作用7,因此需要仔细表征细胞特异性半胱天冬酶水平,以准确了解发育和疾病途径。

这项研究显示了半胱天冬酶在神经血管缺氧缺血 – 视网膜静脉阻塞(RVO)模型中的激活和功能78。在视网膜等复杂组织中,有多种细胞类型可能受到 RVO 诱导的缺氧缺血的影响,包括神经胶质细胞、神经元和脉管系统7。在成年小鼠视网膜中,通过免疫组织化学(IHC)7测量,健康组织中半胱天冬酶的表达很少,但在发育过程中 情况并非如此9或视网膜疾病模型1011。IHC是一种在生物医学研究中成熟的技术,可以验证疾病和病理靶点,通过空间定位和蛋白质量化来识别新角色。如果蛋白质印迹或荧光分析无法检测到裂解的半胱天冬酶产物,也无法通过定位检测不同半胱天冬酶的特定细胞位置或询问半胱天冬酶信号通路,则应使用IHC。

为了确定RVO中功能相关的半胱天冬酶,将IHC与经过验证的半胱天冬酶抗体和细胞标志物一起使用。先前在实验室进行的研究表明,半胱天冬酶-9在缺血性中风和半胱天冬酶-9的抑制模型中被迅速激活,具有高度特异性的抑制剂,可防止神经元功能障碍和死亡12。由于视网膜是中枢神经系统(CNS)的一部分,因此它可作为模型系统来查询和进一步研究半胱天冬酶-9在神经血管损伤中的作用13。为此,利用RVO小鼠模型研究半胱天冬酶-9的细胞特异性位置和分布及其在神经血管损伤中的意义。RVO是由血管损伤引起的工作年龄成年人失明的常见原因14。发现半胱天冬酶-9在内皮细胞中以非凋亡方式表达,但不在神经元中表达。

作为一种组织,视网膜的优点是可以可视化为平面安装,允许欣赏血管网络,或作为横截面,突出神经元视网膜层。横截面中半胱天冬酶蛋白表达的定量提供了背景,通过识别半胱天冬酶在视网膜中的定位,半胱天冬酶在视网膜神经元连接和视觉功能中具有潜在关键意义。在鉴定和验证之后,使用鉴定的半胱天冬酶的诱导细胞特异性缺失来实现目标半胱天冬酶的靶向。对于潜在的治疗查询,使用特定工具来抑制活化的半胱天冬酶来测试感兴趣的半胱天冬酶的相关性。对于半胱天冬酶-9,细胞通透性高选择性抑制剂715使用Pen1-XBIR3。对于本报告,使用了具有C57BL / 6J背景的2个月大的男性C57BL / 6J菌株和他莫昔芬诱导的内皮半胱天冬酶-9敲除(iEC Casp9KO)菌株。这些动物暴露于RVO小鼠模型,C57BL / 6J用半胱天冬酶-9选择性抑制剂Pen1-XBir3处理。所描述的方法可以应用于中枢和外周系统中的其它疾病模型715

Protocol

该协议遵循视觉和眼科研究协会(ARVO)关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。啮齿动物实验由哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准和监测。 1.视网膜组织的制备和冷冻切片 通过给予腹膜内麻醉(氯胺酮(80-100mg / kg)和甲苯噻嗪(5-10mg / kg))对动物实施安乐死,并使用蠕动泵用4%多聚甲醛(PFA)灌注接受RVO的小鼠(详见…

Representative Results

所述协议允许用户分析和量化视网膜组织中的半胱天冬酶-9水平。此外,它还提供了进一步鉴定、验证和特异性靶向半胱天冬酶-9和下游底物的工具。总结的步骤允许对荧光显微照片中的半胱天冬酶水平和细胞特异性进行可量化分析。所有图均显示了代表性的显微照片和未受伤和 1 天 P-RVO 视网膜横截面中总视网膜、内皮细胞和神经元中指示的半胱天冬酶水平的量化。视网膜横截面允许在用 Hoechst ?…

Discussion

半胱天冬酶是一个多成员蛋白酶家族,最好研究它们在细胞死亡和炎症中的作用;然而,最近发现了一些家庭成员的各种非死亡功能45。我们对半胱天冬酶功能的大部分理解来自细胞培养的工作和人类疾病的推断数据。虽然可以理解半胱天冬酶在疾病中的异常诱导、激活或失活,但从功能上确定半胱天冬酶是否驱动疾病病理一直具有挑战性。许多用于?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了美国国家科学基金会研究生研究奖学金计划(NSF-GRFP)资助DGE – 1644869和美国国立卫生研究院(NIH)国家神经疾病和中风研究所(NINDS)的支持,奖励号F99NS124180 NIH NINDS多样性专业F99(CKCO),国家眼科研究所(NEI)5T32EY013933(AMP),国家神经系统疾病和中风研究所(RO1 NS081333, R03 NS099920 to CMT)和国防部陆军/空军(DURIP到CMT)。

Materials

anti-Caspase-7 488 Novus Biologicals NB-56529AF488 use at 1:150
anti-cl-Caspase-9 Cell Signaling 9505-S use at 1:800
anti-CD31 BD Pharmingen 553370 use at 1:50
Confocal Spinning Disc Microscope Biovision
FIJI 2.3.0 open source
Fluormount G Fisher 50-187-88
Forcep Roboz RS-5015
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice lab generated see Avrutsky 2020
Isolectin (594, 649) Vector DL-1207 use at 1:200
Ketamine Hydrochloride Henry Schein NDC: 11695-0702-1
Perfusion pump  Masterflex
Pen1-XBir3 lab generated see Avrutsky 2020
Prism 9.1 GraphPad
Tissue-Tek O.C.T. Fisher 14-373-65
Vis-a-View 4.0 Visitron Systems
Xylazine Akorn NDCL 59399-110-20

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Colón Ortiz, C. K., Potenski, A. M., Johnson, K. V., Chen, C. W., Snipas, S. J., Jean, Y. Y., Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue. J. Vis. Exp. (185), e64237, doi:10.3791/64237 (2022).

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