Sezieren der zellautonomen Funktion des fragilen X-mentalen Retardierungsproteins in einem auditorischen Schaltkreis durch In-Ovo-Elektroporation

Das Fragile-X-Syndrom (FXS) ist eine neurologische Entwicklungsstörung, die durch geistige Behinderung, sensorische Anomalien und autistisches Verhalten gekennzeichnet ist. In den meisten Fällen wird FXS durch einen globalen Verlust des fragilen X-Mentalretardierungsproteins (FMRP; kodiert durch das Fmr1-Gen) ab frühen embryonalen Stadien¹ verursacht. FMRP ist ein RNA-bindendes Protein, das normalerweise in den meisten Neuronen und Gliazellen im Gehirn sowie in Sinnesorganen^{exprimiert wird 2,3,4}. In Säugetiergehirnen ist FMRP wahrscheinlich mit Hunderten von mRNAs assoziiert, die Proteine kodieren, die für verschiedene neuronale Aktivitäten wichtig sind⁵. Studien an konventionellen Fmr1-Knockout-Tieren zeigten, dass die FMRP-Expression besonders wichtig für den Aufbau und die Plastizität der synaptischen Neurotransmission ist⁶. Mehrere bedingte und mosaikartige Knockout-Modelle haben weiter gezeigt, dass FMRP-Aktionen und -Signale zwischen Gehirnregionen, Zelltypen und synaptischen Stellen während mehrerer Entwicklungsereignisse variieren, einschließlich axonaler Projektion, dendritischer Musterung und synaptischer Plastizität 7,8,9,10,11,12,13,14 . Die akute Funktion von FMRP bei der Regulierung der synaptischen Übertragung wurde durch intrazelluläre Verabreichung von inhibitorischen FMRP-Antikörpern oder FMRP selbst in Gehirnschnitten oder kultivierten Neuronen untersucht^15,16,17,18. Diese Methoden bieten jedoch nicht die Möglichkeit, FMRP-Fehlausdrucksfolgen während der Entwicklung zu verfolgen. Daher ist die Entwicklung von In-vivo-Methoden zur Untersuchung der zellautonomen Funktionen von FMRP von großem Bedarf und soll dazu beitragen, festzustellen, ob die berichteten Anomalien bei FXS-Patienten direkte Folgen des FMRP-Verlusts in den zugehörigen Neuronen und Schaltkreisen oder sekundäre Konsequenzen sind, die sich aus netzwerkweiten Veränderungen während der Entwicklung ergeben¹⁹.

Der auditorische Hirnstamm von Hühnerembryonen bietet ein einzigartig vorteilhaftes Modell für eingehende funktionelle Analysen der FMRP-Regulation in der Schaltkreis- und Synapsenentwicklung. Der einfache Zugang zu embryonalen Hühnergehirnen und die etablierte Elektroporationstechnik zur genetischen Manipulation haben wesentlich zu unserem Verständnis der Gehirnentwicklung in frühen embryonalen Stadien beigetragen. In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurde diese Technik mit fortschrittlichen molekularen Werkzeugen kombiniert, die eine zeitliche Kontrolle der FMRP-Fehlexpression ermöglichen^20,21. Hier wird die Methodik weiterentwickelt, um selektive Manipulationen von präsynaptischen und postsynaptischen Neuronen getrennt voneinander zu induzieren. Diese Methode wurde im auditorischen Hirnstammkreislauf entwickelt. Das akustische Signal wird von Haarzellen im auditorischen Innenohr detektiert und dann an das Hörganglion (AG; bei Säugetieren auch Spiralganglion genannt) weitergeleitet. Bipolare Neuronen in der AG innervieren Haarzellen mit ihren peripheren Fortsätzen und senden wiederum eine zentrale Projektion (den Hörnerv) zum Hirnstamm, wo sie in zwei primären Cochlea-Kernen, dem Nucleus magnocellularis (NM) und dem Nucleus angularis (NA), enden. Neuronen in der NM sind strukturell und funktionell vergleichbar mit den kugelförmigen buschigen Zellen des anteroventralen Cochlea-Kerns von Säugetieren. Innerhalb der NM synapsieren Hörnervenfasern (ANFs) auf den Somata von NM-Neuronen über den großen Endbulb der Held-Terminals²². Während der Entwicklung entstehen NM-Neuronen aus den Rhombomeren 5 und 6 (r5/6) im Hinterhirn²³, während AG-Neuronen von Neuroblasten abgeleitet werden, die sich in der Otozyste²⁴ befinden. Hier beschreiben wir das Verfahren zur selektiven Knockdown-FMRP-Expression in den präsynaptischen AG-Neuronen und in den postsynaptischen NM-Neuronen getrennt.