Aqui descrevemos um protocolo detalhado para gerar culturas altamente enriquecidas de astrócitos derivados de diferentes regiões do sistema nervoso central de camundongos pós-natais e sua conversão direta em neurônios funcionais pela expressão forçada de fatores de transcrição.
A reprogramação neuronal direta é uma abordagem poderosa para gerar neurônios funcionais de diferentes populações de células iniciantes sem passar por intermediários multipotentes. Essa técnica não só mantém grandes promessas no campo da modelagem da doença, como permite converter, por exemplo, fibroblastos para pacientes que sofrem de doenças neurodegenerativas em neurônios, mas também representa uma alternativa promissora para terapias de substituição baseadas em células. Nesse contexto, um grande avanço científico foi a demonstração de que células não neurais diferenciadas dentro do sistema nervoso central, como os astrócitos, poderiam ser convertidas em neurônios funcionais in vitro. Desde então, a reprogramação direta in vitro de astrócitos em neurônios forneceu insights substanciais sobre os mecanismos moleculares subjacentes à conversão de identidade forçada e os obstáculos que impedem a reprogramação eficiente. No entanto, os resultados de experimentos in vitro realizados em diferentes laboratórios são difíceis de comparar devido a diferenças nos métodos utilizados para isolar, cultura e reprogramar astrócitos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolar e cultivar astrócitos com alta pureza de diferentes regiões do sistema nervoso central de camundongos em idades pós-natal através da triagem de células magnéticas. Além disso, fornecemos protocolos para reprogramar astrócitos cultivados em neurônios via transdução viral ou transfecção de DNA. Este protocolo simplificado e padronizado pode ser usado para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à manutenção da identidade celular, o estabelecimento de uma nova identidade neuronal, bem como a geração de subtipos neuronais específicos e suas propriedades funcionais.
O sistema nervoso central dos mamíferos (SNC) é altamente complexo, consistindo de centenas de tipos de células diferentes, incluindo um grande número de diferentes subtipos neuronais 1,2,3,4,5,6. Ao contrário de outros órgãos ou tecidos 7,8,9, o CNS mamífero tem uma capacidade regenerativa muito limitada; a perda neuronal após lesão cerebral traumática ou neurodegeneração é irreversível e muitas vezes resulta em déficits motores e cognitivos10. Com o objetivo de resgatar funções cerebrais, diferentes estratégias para substituir neurônios perdidos estão sob intensa investigação11. Entre eles, a reprogramação direta de células somáticas em neurônios funcionais está emergindo como uma abordagem terapêutica promissora12. Reprogramação direta, ou transdiferenciação, é o processo de conversão de um tipo de célula diferenciada em uma nova identidade sem passar por um estado de proliferação intermediária ou pluripotente 13,14,15,16. Pioneiro pela identificação do MyoD1 como fator suficiente para converter fibroblastos em células musculares17,18, este método foi aplicado com sucesso para reprogramar vários tipos celulares em neurônios funcionais 19,20,21.
Os astrócitos, a macroglia mais abundante no CNS22,23, são um tipo celular particularmente promissor para reprogramação neuronal direta por várias razões. Em primeiro lugar, eles são amplamente e uniformemente distribuídos através do CNS, fornecendo uma abundante fonte in loco para novos neurônios. Em segundo lugar, os astrócitos e os neurônios estão intimamente relacionados, pois compartilham um ancestral comum durante o desenvolvimento embrionário, as células gliaisradiais 24. A origem embrionária comum dos dois tipos de células parece facilitar a conversão neuronal em comparação com a reprogramação de células de diferentes camadas germinativas19,21. Além disso, a padronização das informações herdadas pelos astrócitos através de sua origem radial glia também é mantida em astrócitos adultos 25,26,27, e parece contribuir para a geração de subtipos neuronais regionalmente apropriados 28,29,30. Assim, investigar e entender a conversão de astrócitos em neurônios é uma parte importante para alcançar todo o potencial dessa técnica para estratégias de substituição baseadas em células.
A conversão de astrócitos in vitro cultivados em neurônios levou a vários avanços no campo da reprogramação neuronal direta, incluindo: i) a identificação de fatores de transcrição suficientes para gerar neurônios a partir de astrócitos 15,19,31, ii) o desenrolar de mecanismos moleculares desencadeados por diferentes fatores de reprogramação no mesmo contexto celular 32 , e iii) destacando o impacto da origem do desenvolvimento dos astrócitos na indução de diferentes subtipos neuronais 28,29,33. Além disso, a conversão direta in vitro de astrócitos desvendou vários obstáculos importantes que limitam a reprogramação neuronal direta34,35, como o aumento da produção de oxigênio reativo (ROS)34 e diferenças entre o proteome mitocondrial de astrócitos e neurônios35. Assim, essas observações apoiam fortemente o uso de culturas primárias de astrócitos como modelo de reprogramação neuronal direta para investigar várias questões fundamentais na biologia12, relacionadas à manutenção da identidade celular, bloqueios nas estradas que impedem mudanças no destino celular, bem como o papel do metabolismo na reprogramação.
Aqui apresentamos um protocolo detalhado para isolar os astrócitos de camundongos na idade pós-natal (P) com pureza muito alta, como demonstrado pela isolação de astrócitos da medula espinhal murina29. Também fornecemos protocolos para reprogramar astrócitos em neurônios via transdução viral ou transfecção plasmida de DNA. As células reprogramadas podem ser analisadas em 7 dias após a transdução (7 DPT) para avaliar vários aspectos, como eficiência de reprogramação e morfologia neuronal, ou podem ser mantidas na cultura por várias semanas, para avaliar seu amadurecimento ao longo do tempo. É importante ressaltar que este protocolo não é específico para astrócitos da medula espinhal e pode ser facilmente aplicado para isolar astrócitos de várias outras regiões cerebrais, incluindo a matéria cinzenta cortical, o cérebro médio e o cerebelo.
Culturas primárias de astrócitos murinos são um notável sistema de modelo in vitro para estudar a reprogramação neuronal direta. De fato, apesar de estarem isoladas em um estágio pós-natal, as células expressam marcadores astrócitos típicos29, retêm a expressão de genes padronizados28,29 e mantêm a capacidade de proliferação, semelhante aos astrócitos in vivo aos38 anos. Após o is…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Ines Mühlhahn pela clonagem das construções para reprogramação, Paulina Chlebik pela produção viral, e Magdalena Götz e Judith Fischer-Sternjak pelos comentários sobre o manuscrito.
0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
BDNF | Peprotech | 450-02 | |
bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
GDNF | Peprotech | 450-10 | |
gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
NT3 | Peprotech | 450-03 | |
octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |