Summary

Isolamento e riprogrammazione neuronale diretta degli astrociti di topo

Published: July 07, 2022
doi:

Summary

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per generare colture altamente arricchite di astrociti derivati da diverse regioni del sistema nervoso centrale dei topi postnatali e la loro conversione diretta in neuroni funzionali mediante l’espressione forzata di fattori di trascrizione.

Abstract

La riprogrammazione neuronale diretta è un approccio potente per generare neuroni funzionali da diverse popolazioni di cellule starter senza passare attraverso intermedi multipotenti. Questa tecnica non solo ha grandi promesse nel campo della modellazione delle malattie, in quanto consente di convertire, ad esempio, i fibroblasti per i pazienti affetti da malattie neurodegenerative in neuroni, ma rappresenta anche un’alternativa promettente per le terapie sostitutive basate sulle cellule. In questo contesto, un importante passo avanti scientifico è stata la dimostrazione che le cellule non neurali differenziate all’interno del sistema nervoso centrale, come gli astrociti, potrebbero essere convertite in neuroni funzionali in vitro. Da allora, la riprogrammazione diretta in vitro degli astrociti in neuroni ha fornito informazioni sostanziali sui meccanismi molecolari alla base della conversione forzata dell’identità e sugli ostacoli che impediscono una riprogrammazione efficiente. Tuttavia, i risultati di esperimenti in vitro eseguiti in diversi laboratori sono difficili da confrontare a causa delle differenze nei metodi utilizzati per isolare, coltivare e riprogrammare gli astrociti. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare e coltivare in modo affidabile astrociti con elevata purezza da diverse regioni del sistema nervoso centrale dei topi in età postnatale tramite selezione di cellule magnetiche. Inoltre, forniamo protocolli per riprogrammare astrociti coltivati in neuroni tramite trasduzione virale o trasfezione del DNA. Questo protocollo semplificato e standardizzato può essere utilizzato per studiare i meccanismi molecolari alla base del mantenimento dell’identità cellulare, la creazione di una nuova identità neuronale, nonché la generazione di specifici sottotipi neuronali e le loro proprietà funzionali.

Introduction

Il sistema nervoso centrale (SNC) dei mammiferi è altamente complesso, costituito da centinaia di diversi tipi di cellule, tra cui un vasto numero di diversi sottotipi neuronali 1,2,3,4,5,6. A differenza di altri organi o tessuti 7,8,9, il SNC dei mammiferi ha una capacità rigenerativa molto limitata; la perdita neuronale a seguito di lesioni cerebrali traumatiche o neurodegenerazione è irreversibile e spesso si traduce in deficit motori e cognitivi10. Con l’obiettivo di salvare le funzioni cerebrali, diverse strategie per sostituire i neuroni persi sono oggetto di intense indagini11. Tra questi, la riprogrammazione diretta delle cellule somatiche in neuroni funzionali sta emergendo come un approccio terapeutico promettente12. La riprogrammazione diretta, o transdifferenziazione, è il processo di conversione di un tipo di cellula differenziata in una nuova identità senza passare attraverso uno stato proliferativo o pluripotente intermedio 13,14,15,16. Pioniere dell’identificazione di MyoD1 come fattore sufficiente per convertire i fibroblasti in cellule muscolari17,18, questo metodo è stato applicato con successo per riprogrammare diversi tipi di cellule in neuroni funzionali 19,20,21.

Gli astrociti, la macroglia più abbondante nel SNC22,23, sono un tipo di cellula particolarmente promettente per la riprogrammazione neuronale diretta per diversi motivi. In primo luogo, sono ampiamente e uniformemente distribuiti attraverso il SNC, fornendo un’abbondante fonte in loco per i nuovi neuroni. In secondo luogo, gli astrociti e i neuroni sono strettamente correlati allo sviluppo, in quanto condividono un antenato comune durante lo sviluppo embrionale, le cellule gliali radiali24. L’origine embrionale comune dei due tipi di cellule sembra facilitare la conversione neuronale rispetto alla riprogrammazione di cellule provenienti da diversi strati germinali19,21. Inoltre, le informazioni di pattern ereditate dagli astrociti attraverso la loro origine glia radiale sono mantenute anche negli astrociti adulti 25,26,27 e sembrano contribuire alla generazione di sottotipi neuronali appropriati a livello regionale 28,29,30. Quindi, studiare e comprendere la conversione degli astrociti in neuroni è una parte importante del raggiungimento del pieno potenziale di questa tecnica per le strategie di sostituzione basate sulle cellule.

La conversione di astrociti in coltura in vitro in neuroni ha portato a diverse scoperte nel campo della riprogrammazione neuronale diretta, tra cui: i) l’identificazione di fattori di trascrizione sufficienti a generare neuroni dagli astrociti 15,19,31, ii) il dipanarsi di meccanismi molecolari innescati da diversi fattori di riprogrammazione nello stesso contesto cellulare 32 , e iii) evidenziando l’impatto dell’origine evolutiva degli astrociti sull’induzione di diversi sottotipi neuronali 28,29,33. Inoltre, la conversione diretta in vitro degli astrociti ha svelato diversi ostacoli importanti che limitano la riprogrammazione neuronale diretta34,35, come l’aumento della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS)34 e le differenze tra il proteoma mitocondriale degli astrociti e i neuroni35. Quindi, queste osservazioni supportano fortemente l’uso di colture primarie di astrociti come modello per la riprogrammazione neuronale diretta per indagare diverse questioni fondamentali in biologia12, relative al mantenimento dell’identità cellulare, agli ostacoli che impediscono i cambiamenti del destino cellulare e al ruolo del metabolismo nella riprogrammazione.

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per isolare astrociti da topi in età postnatale (P) con purezza molto elevata, come dimostrato isolando astrociti dal midollo spinale murino29. Forniamo anche protocolli per riprogrammare gli astrociti in neuroni tramite trasduzione virale o trasfezione del plasmide del DNA. Le cellule riprogrammate possono essere analizzate a 7 giorni dopo la trasduzione (7 DPT) per valutare vari aspetti, come l’efficienza di riprogrammazione e la morfologia neuronale, oppure possono essere mantenute in coltura per diverse settimane, per valutarne la maturazione nel tempo. È importante sottolineare che questo protocollo non è specifico per gli astrociti del midollo spinale e può essere prontamente applicato per isolare gli astrociti da varie altre regioni del cervello, tra cui la materia grigia corticale, il mesencefalo e il cervelletto.

Protocol

La seguente procedura segue le linee guida per la cura degli animali dell’Helmholtz Zentrum Munich in conformità con la direttiva 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. Assicurati di rispettare le linee guida per la cura degli animali dell’istituzione in cui viene eseguita la dissezione. 1. Preparazione di materiali per dissezione, dissociazione e coltura NOTA: Preparare tutti i reagenti di coltura all’interno di un …

Representative Results

Le colture primarie di astrociti raggiungono tipicamente l’80% -90% di confluenza tra 7 e 10 giorni dopo lo smistamento e la placcatura MAC (Figura 1B). Generalmente, un singolo pallone di coltura T25 produce circa 1-1,5 x 106 cellule, che è sufficiente per 20-30 coverslip quando si seminano le cellule ad una densità di 5-5,5 x 104 cellule per pozzetto. Il giorno dopo la placcatura, le celle coprono in genere il 50%-60% della superficie del coverslip (<strong class="x…

Discussion

Le colture primarie di astrociti murini sono un notevole sistema modello in vitro per studiare la riprogrammazione neuronale diretta. Infatti, nonostante siano isolate in uno stadio postnatale, le cellule esprimono i tipici marcatori astrocitari29, mantengono l’espressione dei genipatterning 28,29 e mantengono la capacità di proliferare, simile agli astrociti in vivo ad un’età comparabiledi 38 an…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Ines Mühlhahn per aver clonato i costrutti per la riprogrammazione, Paulina Chlebik per la produzione virale e Magdalena Götz e Judith Fischer-Sternjak per i commenti sul manoscritto.

Materials

0.05% Trypsin/EDTA Life Technologies 25300054
4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) Sigma-Aldrich D9564
anti-mouse IgG1 Alexa 647 Thermo Fisher A21240
anti-Mouse IgG1 Biotin Southernbiotech Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413
anti-mouse IgG2b Alexa 488 Thermo Fisher A21121
anti-rabbit Alexa 546 Thermo Fisher A11010
Aqua Poly/Mount Polysciences Cat# 18606-20
B27 Supplement Life Technologies 17504044
BDNF Peprotech 450-02
bFGF Life Technologies 13256029
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich Cat# A9418
cAMP Sigma Aldrich D0260
C-Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
DMEM/F12 Life Technologies 21331020
Dorsomorphin Sigma Aldrich P5499
EGF Life Technologies PHG0311
Fetal Bovine Serum PAN Biotech P30-3302
Forskolin Sigma Aldrich F6886
GDNF Peprotech 450-10
gentleMACS Octo Dissociator Miltenyi Biotec 130-096-427
GFAP Dako Cat# Z0334; RRID: AB_100013482
Glucose Sigma Aldrich G8769
GlutaMax Life Technologies 35050038
HBSS Life Technologies 14025050
Hepes Life Technologies 15630056
Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) Thermo Fisher Cat# 11668019
MACS SmartStrainer 70µm Miltenyi Biotec 130-098-462
MiniMACS Seperator Miltenyi Biotec 130-042-102
Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit  Miltenyi Biotec 130-097-678
Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 Synaptic Systems Cat# 101 011 RRID:AB_887824)
Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) Sigma Aldrich T8660
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
N2 Supplement Life Technologies 17502048
Neural Tissue Dissociation Kit  Miltenyi Biotec 130-092-628
NT3 Peprotech 450-03
octoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109
OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) Thermo Fisher Cat# 51985-026
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140122
Poly-D-Lysine Sigma Aldrich P1149
Rabbit anti-RFP Rockland Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751
Rabbit anti-Sox9 Sigma-Aldrich Cat# AB5535; RRID:AB_2239761
Streptavidin Alexa 405 Thermo Fisher Cat# S32351
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# T9284

Referenzen

  1. Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).
  2. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  3. Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
  4. Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
  5. Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
  6. Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  7. Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).
  8. Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration – a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
  9. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
  10. Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).
  11. Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
  12. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  13. Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
  14. Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
  15. Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).
  16. Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
  17. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
  18. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  19. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  20. Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  21. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  22. Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
  23. Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).
  24. Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  25. Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).
  26. Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
  27. Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).
  28. Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
  29. Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).
  30. Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
  31. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
  32. Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
  33. Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
  34. Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
  35. Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
  36. Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
  37. Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
  38. Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
  39. Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
  40. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
  41. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).

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Diesen Artikel zitieren
Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes. J. Vis. Exp. (185), e64175, doi:10.3791/64175 (2022).

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