Summary

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

Published: June 16, 2022
doi:

Summary

Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell’orecchio interno aviario.

Abstract

L’orecchio interno percepisce il suono e mantiene l’equilibrio usando la coclea e il vestibolo. Lo fa utilizzando un tipo di cellula meccanosensoriale dedicata nota come cellula ciliata. La ricerca di base nell’orecchio interno ha portato a una profonda comprensione di come funziona la cellula ciliata e di come la disregolazione può portare a perdita dell’udito e vertigini. Per questa ricerca, il topo è stato il sistema modello preminente. Tuttavia, i topi, come tutti i mammiferi, hanno perso la capacità di sostituire le cellule ciliate. Pertanto, quando si cerca di comprendere le terapie cellulari per ripristinare la funzione dell’orecchio interno, studi complementari in altre specie di vertebrati potrebbero fornire ulteriori approfondimenti. L’epitelio uditivo degli uccelli, la papilla basilare (BP), è un foglio di epitelio composto da cellule ciliate meccanosensoriali (HC) intercalate da cellule di supporto (SC). Sebbene l’architettura anatomica della papilla basilare e della coclea dei mammiferi differisca, i meccanismi molecolari dello sviluppo dell’orecchio interno e dell’udito sono simili. Questo rende la papilla basilare un sistema utile non solo per studi comparativi, ma anche per comprendere la rigenerazione. Qui, descriviamo le tecniche di dissezione e manipolazione per l’orecchio interno del pollo. La tecnica mostra metodi di inibizione genetica e di piccole molecole, che offrono un potente strumento per studiare i meccanismi molecolari dello sviluppo dell’orecchio interno. In questo articolo, discutiamo in ovo tecniche di elettroporazione per perturbare geneticamente la papilla basilare usando delezioni CRIPSR-Cas9, seguite dalla dissezione della papilla basilare. Dimostriamo anche la coltura dell’organo BP e l’uso ottimale delle matrici di coltura, per osservare lo sviluppo dell’epitelio e delle cellule ciliate.

Introduction

L’orecchio interno di tutti i vertebrati deriva da un semplice epitelio noto come placode otico 1,2. Ciò darà origine a tutti gli elementi strutturali e ai tipi cellulari necessari per trasdurre le informazioni meccanosensoriali associate all’udito e all’equilibrio della percezione. Le cellule ciliate (HC), il sensore ciliato dell’orecchio interno, sono circondate da cellule di supporto (SC). Gli HC trasmettono informazioni al cervello posteriore uditivo attraverso i neuroni dell’ottavo nervo cranico. Questi sono anche generati dal placode otico3. La trasduzione primaria del suono si ottiene sulla superficie apicale dell’HC uditivo, attraverso un fascio di capelli meccanicamente sensibile4. Questo è mediato attraverso protrusioni modificate a base di actina chiamate stereociglia, che sono disposte in un modello graduato di scala5. Inoltre, un ciglio primario modificato, chiamato kinocilium, organizza la formazione di fasci di capelli ed è adiacente alla fila più alta di stereociglia 6,7,8. L’architettura delle stereociglia è fondamentale per questo ruolo nella conversione di stimoli meccanici derivati dall’energia acustica in segnali neurali elettrici9. Danni all’HC uditivo dovuti all’invecchiamento, all’infezione, al trauma otoacustico o allo shock ototossico possono provocare una perdita parziale o completa dell’udito che, nei mammiferi, è irreversibile10.

Sono state proposte terapie cellulari sostitutive che potrebbero riparare tali danni11,12. L’approccio di questa ricerca è stato quello di comprendere il normale sviluppo della cellula ciliata dei mammiferi e chiedere se i programmi di sviluppo possono essere riavviati in cellule simili a progenitori che possono esistere all’interno dell’orecchio interno13. Un secondo approccio è stato quello di guardare al di fuori dei mammiferi, ai vertebrati non mammiferi in cui avviene una robusta rigenerazione delle cellule ciliate uditive, come gli uccelli14,15. Negli uccelli, la rigenerazione delle cellule ciliate avviene prevalentemente attraverso la de-differenziazione di una cellula di supporto in uno stato simile a un progenitore, seguita da una divisione mitotica asimmetrica per generare una cellula ciliata e una cellula di supporto16. Inoltre, è stata osservata anche la differenziazione diretta di una cellula di supporto per generare una cellula ciliata17.

Mentre i meccanismi dello sviluppo uditivo aviario mostrano somiglianze significative con quello dei mammiferi, ci sono differenze18. La differenziazione di HC e SC nel pulcino BP è evidente dal giorno embrionale (E) 7, diventando più distinta nel tempo. Con E12, è possibile visualizzare una papilla basilare (BP) ben modellata e ben polarizzata, e da E17 si possono vedere cellule ciliate ben sviluppate19. Questi punti temporali forniscono finestre sui meccanismi di differenziazione, pattern e polarità, nonché sulla maturazione delle cellule ciliate. Capire se tali meccanismi sono conservati o divergenti è importante, in quanto forniscono informazioni sulla profonda omologia delle origini delle cellule ciliate meccanosensoriali.

Qui, dimostriamo una serie di tecniche eseguite nelle fasi embrionali iniziali e tardive per studiare i processi cellulari come la proliferazione, la specifica del destino, la differenziazione, il pattern e il mantenimento durante lo sviluppo dell’organo dell’orecchio interno. Questo integra altri protocolli sulla comprensione dello sviluppo dell’orecchio interno nella coltura di espianti20,21,22. Per prima cosa discutiamo l’introduzione di DNA esogeno o RNA nei precursori della BP all’interno dell’otocisti E3.5 utilizzando l’elettroporazione ovo. Sebbene le manipolazioni genetiche possano fornire preziose informazioni, i fenotipi così generati possono essere pleiotropici e di conseguenza confondenti. Ciò è particolarmente vero durante il successivo sviluppo dell’orecchio interno, dove processi fondamentali come il rimodellamento citoscheletrico svolgono molteplici ruoli nella divisione cellulare, nella morfogenesi dei tessuti e nella specializzazione cellulare. Presentiamo protocolli per l’inibizione farmacologica negli espianti in coltura, che offrono vantaggi nel controllo del dosaggio e dei tempi e della durata del trattamento, offrendo una precisa manipolazione spaziotemporale dei meccanismi di sviluppo.

Diversi metodi di coltura degli organi possono essere utilizzati a seconda della durata del trattamento di piccoli inibitori. Qui dimostriamo due metodi di coltura degli organi che consentono approfondimenti sulla morfogenesi epiteliale e sulla specializzazione cellulare. Un metodo per la coltura 3D che utilizza il collagene come matrice per coltivare il dotto cocleare consente una coltura robusta e una visualizzazione dal vivo della BP in via di sviluppo. Per comprendere la formazione di stereociglia, presentiamo un metodo di coltura a membrana tale che il tessuto epiteliale viene coltivato su una matrice rigida che consente alle protrusioni di actina di crescere liberamente. Entrambi i metodi consentono l’elaborazione a valle come l’imaging di cellule vive, l’immunoistochimica, la microscopia elettronica a scansione (SEM), la registrazione cellulare, ecc. Queste tecniche forniscono una tabella di marcia per l’uso efficace del pulcino come sistema modello per comprendere e manipolare lo sviluppo, la maturazione e la rigenerazione dell’epitelio uditivo aviario.

Protocol

I protocolli che coinvolgono l’approvvigionamento, la coltura e l’uso di uova di gallina fecondate ed embrioni non nati sono stati approvati dal Comitato etico animale istituzionale del Centro nazionale per le scienze biologiche, Bangalore, Karnataka. 1. Elettroporazione in ovo di precursori uditivi pulcini Progettazione e clonazione di sgRNA per il knockout del gene CRISPR/Cas9Per la creazione di knockout genici, gli RNA guida alla progettazione per…

Representative Results

Nella configurazione dell’elettroporazione, il posizionamento degli elettrodi può svolgere un ruolo nel dominio della trasfezione. L’elettrodo positivo è posto sotto il tuorlo e il negativo sopra l’embrione (Figura 1A). Ciò si traduce in una maggiore espressione di GFP in gran parte dell’orecchio interno e di entrambi gli organi vestibolari (Figura 1B) e nella papilla basilare uditiva (Figura 1C, D), confermando …

Discussion

Il pulcino è un’aggiunta economica e conveniente agli organismi modello che un laboratorio può utilizzare per la ricerca sull’orecchio interno. I metodi qui descritti sono abitualmente utilizzati nel nostro laboratorio e completano la ricerca in corso nell’orecchio interno dei mammiferi. Nell’ovo l’elettroporazione viene utilizzata per introdurre manipolazioni genetiche nel genoma del pulcino. L’elettroporazione può anche essere usata per introdurre costrutti che codificano proteine fluorescenti mirate a part…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo con gratitudine il supporto di NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB e Royal National Institute for the Deaf. Vorremmo ringraziare Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru. Siamo grati al supporto di CIFF e EM facility and lab presso NCBS. Ringraziamo Yoshiko Takahashi e Koichi Kawakami per i costrutti Tol2-eGFP e T2TP, e Guy Richardson per l’HCA e l’anticorpo G19 Pcdh15. Siamo grati ai membri di Earlab per il loro costante supporto e prezioso feedback sul protocollo.

Materials

Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 Integrated DNA Technologies 1081061 High fidelity Cas9 protein
Anti-GFP antibody Abcam ab290 Rabbit polyclonal to GFP
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Calcium Chloride Dihydrate Thermo Fisher Scientific Q12135
Collagen I, rat tail Thermo Fisher Scientific A1048301
Critical Point Dryer Leica EM CPD300 Leica
CUY-21 Electroporator Nepagene
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
DM5000B Widefield Microscope Leica
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569010
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252
Fluoroshield Sigma-Aldrich F6182
FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope Olympus
Glutaraldehyde (25 %) Sigma-Aldrich 340855
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11001
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A-11032
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
Goat Serum Sterile filtered HiMedia RM10701 Heat inactivated
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14025092
LSM980 Airyscan Microscope Zeiss
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm Sigma-Aldrich PICM03050
MVX10 Stereo Microscope Olympus
MYO7A antibody DSHB 138-1 Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa
MZ16 Dissecting microscope Leica
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502048
Noyes Scissors, 14cm (5.5'') World Precision Instruments 501237
Osmium tetroxide (4%) Sigma-Aldrich 75632
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PC-10 Puller Narishige
pcU6_1sgRNA Addgene 92395 Mini vector with modified chicken U6 promoter
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich P3032
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
SMZ1500 Dissecting microscope Nikon
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M Electron Microscopy Sciences 11652
Sodium chloride HiMedia GRM853
Sputtre Coater K550X Emitech
Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament World Precision Instruments 1B100-3
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
The MERLIN Compact VP Zeiss
Thiocarbohydrazide Alfa Aesar L01205
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P1379

Referenzen

  1. Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
  2. Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
  3. Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
  4. Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
  5. Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
  6. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
  7. Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
  8. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
  9. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
  10. Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
  11. Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
  12. Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
  13. Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
  14. Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
  15. Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
  16. Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
  17. Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
  18. Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
  19. Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Entwicklungsbiologie. 116 (1), 119-129 (1986).
  20. Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
  21. Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O’Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
  22. Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
  23. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  24. Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Entwicklungsbiologie. 432 (1), 86-97 (2017).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
  26. Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Entwicklungsbiologie. 305 (2), 616-624 (2007).
  27. Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
  28. Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
  29. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  30. Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
  31. Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
  32. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  33. Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
  34. Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
  35. Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
  36. Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
  37. Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
  38. Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
  39. Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Singh, N., Prakash, A., Chakravarthy, S. R., Kaushik, R., Ladher, R. K. In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development. J. Vis. Exp. (184), e64172, doi:10.3791/64172 (2022).

View Video