פרוטוקול זה מתאר את שיטת Capture Hi-C המשמשת לאפיון הארגון התלת-ממדי של אזורים גנומיים ממוקדים בגודל מגה-מבוסס ברזולוציה גבוהה, כולל גבולות של תחומים משויכים טופולוגית (TADs) ואינטראקציות כרומטין ארוכות טווח בין אלמנטים רגולטוריים ורצפי DNA אחרים.
הארגון המרחבי של הגנום תורם לתפקודו ולוויסותו בהקשרים רבים, כולל שעתוק, שכפול, רקומבינציה ותיקון. הבנת הסיבתיות המדויקת בין טופולוגיית הגנום לתפקוד היא אפוא חיונית והופכת יותר ויותר לנושא למחקר אינטנסיבי. טכנולוגיות לכידת קונפורמציה של כרומוזומים (3C) מאפשרות להסיק את המבנה התלת-ממדי של הכרומטין על ידי מדידת תדירות האינטראקציות בין כל אזור בגנום. כאן אנו מתארים פרוטוקול מהיר ופשוט לביצוע Capture Hi-C, שיטת העשרת מטרות מבוססת 3C המאפיינת את הארגון התלת-ממדי הספציפי לאלל של מטרות גנומיות בגודל מגה-מבוסס ברזולוציה גבוהה. ב- Capture Hi-C, אזורי המטרה נלכדים על ידי מערך של גשושיות ביוטיניליות לפני ריצוף במורד הזרם. לפיכך, רזולוציה גבוהה יותר וספציפיות אלל מושגות תוך שיפור יעילות הזמן והמחיר המשתלם של הטכנולוגיה. כדי להדגים את נקודות החוזק שלו, פרוטוקול Capture Hi-C הוחל על מרכז ההפעלה X של העכבר ( Xic), מוקד הבקרה הראשי של השבתת כרומוזום X (XCI).
הגנום הליניארי מכיל את כל המידע הדרוש לאורגניזם כדי לעבור התפתחות עוברית ולשרוד לאורך כל הבגרות. עם זאת, הנחיית תאים זהים גנטית לבצע פונקציות שונות היא בסיסית לשליטה מדויקת במידע המשמש בהקשרים ספציפיים, כולל רקמות שונות ו / או שלבי התפתחות. הארגון התלת-ממדי של הגנום נחשב כמשתתף בוויסות מרחבי-זמני מדויק זה של פעילות הגנים על ידי הקלה או מניעה של אינטראקציה פיזית בין אלמנטים רגולטוריים שניתן להפריד על ידי כמה מאות קילו-בסיסים בגנום הליניארי (עבור סקירות 1,2,3). ב-20 השנים האחרונות, הבנתנו את יחסי הגומלין בין קיפול גנום ופעילות גדלה במהירות, בעיקר הודות לפיתוח טכנולוגיות ללכידת קונפורמציה של כרומוזומים (3C) (לסקירה 4,5,6,7). שיטות אלה מודדות את תדירות האינטראקציות בין אזורים כלשהם בגנום ומסתמכות על קשירת רצפי דנ”א הנמצאים בסמיכות תלת-ממדית בתוך הגרעין. פרוטוקולי 3C הנפוצים ביותר מתחילים בקיבוע אוכלוסיות תאים עם סוכן cross-linking כגון פורמלדהיד. הכרומטין הצולב, לאחר מכן מתעכל עם אנזים הגבלה, אם כי עיכול MNase שימש גם 8,9. לאחר העיכול, קצוות הדנ”א החופשי בקרבה מרחבית קרובים נקשרים מחדש, והקישור הצולב. שלב זה מוליד את “הספרייה” או “התבנית” של 3C, מאגר מעורב של מקטעים היברידיים שבו רצפים שהיו בקרבה תלת-ממדית לגרעין הם בעלי סיכוי גבוה יותר להיקשר באותו מקטע DNA. הכימות במורד הזרם של מקטעים היברידיים אלה מאפשר להסיק את הקונפורמציה התלת-ממדית של אזורים גנומיים הממוקמים אלפי זוגות בסיסים זה מזה בגנום הליניארי, אך עשויים לקיים אינטראקציה במרחב התלת-ממדי.
גישות רבות ושונות פותחו כדי לאפיין את ספריית 3C, הנבדלות זו מזו הן מבחינת תת-קבוצות של מקטעי קשירה מנותחות והן מבחינת הטכנולוגיה המשמשת לכימות במורד הזרם. פרוטוקול 3C המקורי הסתמך על בחירת שני אזורי עניין וכימות תדירות האינטראקציה שלהם ‘אחד מול אחד’ על ידי PCR10,11. גישת 4C (לכידת קונפורמציה מעגלית של כרומוזומים) מודדת את יחסי הגומלין בין מוקד עניין יחיד (כלומר, “נקודת המבט”) לבין שאר הגנום (“אחד מול כולם”)12,13,14. ב-4C, ספריית 3C עוברת סבב שני של עיכול וקשירה מחדש כדי ליצור מולקולות DNA מעגליות קטנות המועצמות ב-PCR על ידי פריימרים ספציפיים לנקודת מבט15. 5C (Chromosome Conformation Capture Carbon Copy) מאפשר אפיון של אינטראקציות תלת-ממדיות על פני אזורי עניין גדולים יותר, ומספק תובנות לגבי קיפול כרומטין מסדר גבוה יותר בתוך אזור זה (“רבים לעומת רבים”)16. ב-5C, ספריית 3C עוברת הכלאה למאגר של אוליגונוקלאוטידים החופפים לאתרי הגבלה שניתן להגביר לאחר מכן על ידי מולטיפלקס PCR עם פריימרים אוניברסליים15. הן ב-4C והן ב-5C, מקטעי הדנ”א האינפורמטיביים כומתו בתחילה על ידי מיקרו-מערכים ומאוחר יותר על ידי ריצוף הדור הבא (NGS)17,18,19. אסטרטגיות אלה מאפיינות אזורי עניין ממוקדים, אך לא ניתן ליישם אותן כדי למפות אינטראקציות ברחבי הגנום. מטרה אחרונה זו מושגת באמצעות Hi-C, אסטרטגיה מבוססת 3C בעלת תפוקה גבוהה שבה ריצוף מקבילי מאסיבי של תבנית 3C מאפשר אפיון בלתי מוטה של קיפול כרומטין ברמת הגנום הרחב (‘הכל לעומת כולם’)20. פרוטוקול Hi-C כולל שילוב של שאריות ביוטינילציה בקצות השברים המעוכלים, ולאחר מכן משיכה כלפי מטה של מקטעי קשירה עם חרוזי סטרפטווידין כדי להגביר את ההתאוששות של שברים קשורים20.
Hi-C גילה כי גנומים של יונקים מאורגנים באופן מבני בקני מידה מרובים בגרעין התלת-ממדי. בסקאלת המגה-בסיס, הגנום מחולק לאזורים של כרומטין, כרומטין, תאים A ו-B, בהתאמה20,21. קיומם של תת-תאים נוספים המיוצגים על ידי מצבי כרומטין ופעילות שונים הוצג גם הוא לאחר מכן22. ברזולוציה גבוהה יותר, הגנום מחולק עוד יותר לתחומים תת-מגה-בסיסים בעלי אינטראקציה עצמית הנקראים תחומים שיוך טופולוגי (TADs), שנחשפו לראשונה על ידי ניתוח Hi-C ו-5C של גנום האדם והעכבר23,24. בניגוד לתאים המשתנים באופן ספציפי לרקמות, TADs נוטים להיות קבועים (אם כי ישנם יוצאים מן הכלל רבים). חשוב לציין, גבולות TAD נשמרים בין מינים25. בתאי יונקים, TADs כוללים לעתים קרובות גנים החולקים את אותו נוף רגולטורי והוכחו כמייצגים מסגרת מבנית המאפשרת ויסות משותף של גנים תוך הגבלת האינטראקציות עם תחומי בקרה שכנים (לסקירה 3,26,27,28). יתר על כן, בתוך TADs, אינטראקציות עקב אתרי CTCF בבסיס של לולאות cohesin-extruded עשוי להגדיל את ההסתברות של אינטראקציות מקדם-משפר או משפר משפר (לסקירה29).
ב- Hi-C, ניתן לזהות תאים ו- TADs ברזולוציה של 1 Mb עד 40 kb, אך ניתן להשיג רזולוציה גבוהה יותר כדי לאפיין מגעים בקנה מידה קטן יותר כגון אינטראקציות לולאה בין אלמנטים דיסטליים בקנה מידה של 5-10 kb. עם זאת, הגדלת הרזולוציה כדי להיות מסוגל לזהות לולאות כאלה ביעילות על ידי HiC דורש עלייה משמעותית בעומק הרצף, ולכן, עלויות רצף. זה מחמיר אם הניתוח צריך להיות ספציפי אלל. ואכן, עלייה של פי X ברזולוציה דורשת עלייה של X2 בעומק הריצוף, כלומר גישות ברזולוציה גבוהה וספציפיות לאלל יכולות להיות יקרות מאוד30.
כדי לשפר את העלות-תועלת והמחיר המשתלם תוך שמירה על רזולוציה גבוהה, ניתן למשוך פיזית את אזורי היעד המעניינים אותם מספריות 3C או Hi-C רחבות גנום לאחר ההכלאה שלהם עם בדיקות אוליגונוקלאוטידים משלימות המסומנות בביוטין לפני ריצוף במורד הזרם. אסטרטגיות העשרת מטרות אלה מכונות שיטות Capture-C ומאפשרות חקירה של אינטראקציות של מאות מיקומי מטרה הפזורים ברחבי הגנום (כלומר, Promoter Capture (PC) Hi-C; הדור הבא (NG) Capture-C; קלט נמוך (LI) לכידה-C; לכידת טיטרייטד גרעיני (NuTi)-C; Tri-C)31,32,33,34,35,36,37,38,39,40, או על פני אזורים המשתרעים על פני מספר מגה-בסיסים (כלומר, Capture HiC; HYbrid ללכוד Hi-C (Hi-C2); Tiled-C)41,42,43. שני היבטים יכולים להשתנות בשיטות מבוססות לכידה: (1) האופי והעיצוב של אוליגונוקלאוטידים ביוטיניליים (כלומר, RNA או DNA, אוליגוס יחיד לוכד מטרות גנומיות מפוזרות או אוליגוס מרובים המרצפות אזור עניין); ו-(2) התבנית המשמשת למשיכת מטרות כלפי מטה שיכולה להיות ספריית 3C או Hi-C, האחרונה מורכבת מקטעי הגבלה ביוטיניליים שנמשכו מספריית 3C.
כאן מתואר פרוטוקול Capture Hi-C המבוסס על העשרת אנשי קשר יעד מספריית 3C. הפרוטוקול מסתמך על תכנון מערך ריצוף מותאם אישית של בדיקות RNA ביוטינילציה וניתן לבצע אותו תוך שבוע אחד מהכנת ספריית 3C ועד לריצוף NGS. הפרוטוקול מהיר, פשוט, ומאפשר לאפיין ארגון תלת-ממדי מסדר גבוה יותר של אזורי עניין בגודל מגה-בסיס ברזולוציה של 5 קילו-בתים תוך שיפור יעילות הזמן והמחיר המשתלם בהשוואה לשיטות 3C אחרות. פרוטוקול Capture Hi-C הוחל על מוקד הבקרה הראשי של השבתת כרומוזום X (XCI), מרכז X-inactivation (Xic), המארח את ה-RNA הלא מקודד Xist. ה- Xic היה בעבר נושא לניתוחים מבניים ופונקציונליים נרחבים (לסקירה44,45). ביונקים, XCI מפצה על המינון של גנים מקושרי X בין נקבות (XX) לזכרים (XY) וכולל השתקת שעתוק של כמעט כל אחד משני כרומוזומי X בתאי נקבה. ה- Xic ייצג מוקד רב עוצמה ותקן זהב למחקרים בטופולוגיה גנומית תלת-ממדית וליחסי הגומלין עם בקרת גנים44. ניתוח 5C של Xic בתאי גזע עובריים של עכברים (mESCs) הוביל לגילוי ושיום של TADs, וסיפק את התובנות הראשונות לגבי הרלוונטיות התפקודית של חלוקה טופולוגית וויסות משותף של גנים24. הארגון הטופולוגי של ה-Xic הוכח לאחר מכן כמעורב באופן קריטי בתזמון ההתפתחותי המתאים של Xist upregulation ו-XCI 46, ואלמנטים לא חשודים של cis-regulatory שיכולים להשפיע על פעילות גנים בתוך ובין TADs התגלו לאחרונה גם בתוך Xic47,48,49. החלת Capture Hi-C על 3 Mb של כרומוזום X של העכבר המשתרע על פני Xic מדגימה את כוחה של גישה זו בניתוח קיפול כרומטין בקנה מידה גדול ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול מפורט וקל למעקב מסופק, החל מתכנון מערך הגשושיות הביוטיניליות בכל אתר הגבלת DpnII באזור העניין ועד ליצירת ספריית 3C רחבת גנום, הכלאה ולכידת אנשי קשר מטרה, וניתוח נתונים במורד הזרם. כמו כן נכללת סקירה כללית של בקרות האיכות המתאימות והתוצאות הצפויות, והן נקודות החוזק והמגבלות של הגישה נדונות לאור שיטות קיימות דומות.
כאן אנו מתארים פרוטוקול Capture Hi-C מהיר וקל יחסית לאפיון ארגון מסדר גבוה יותר של אזורים גנומיים בגודל מגה-בסיס ברזולוציה של 5-10 קילובייט. Capture Hi-C שייך למשפחת טכנולוגיות Capture-C שנועדו להעשיר אינטראקציות כרומטין ממוקדות מתבניות 3C או Hi-C ברחבי הגנום. עד כה, הרוב הגדול של יישומי Capture-C נוצלו למיפוי מגעי כרומטין של אלמנטים רגולטוריים קטנים יחסית המפוזרים על פני הגנום כולו. בפרוטוקול Capture-C הראשון, נעשה שימוש במספר בדיקות RNA ביוטיניליות חופפות כדי ללכוד >400 מקדמים שנבחרו מראש בספריות 3C שהוכנו מתאי אריתרואידים31. אותה אסטרטגיה שופרה לאחר מכן ב-Next Generation (NG) וב-Nuclear Titrated (NuTi) Capture-C כדי להשיג פרופילי אינטראקציה ברזולוציה גבוהה של >8,000 מקדמים באמצעות פיתיונות DNA בודדים של 120 bp המתפרשים על פני אתרי הגבלה בודדים ושני סבבי לכידה עוקבים כדי למקסם את ההעשרה של מקטעי קשירה אינפורמטיביים32,40. אסטרטגיות אלה הובילו לדיסקציה תפקודית של אלמנטים הפועלים על ידי CIS בהקשרים רבים ושונים, כולל התפתחות עוברית עכבר, התמיינות תאים, השבתה של כרומוזום X ובקרה שגויה של גנים בתנאים פתולוגיים 46,63,65,66,67,68,69,70,71.
ב-Promoter Capture Hi-C (PCHi-C), >22,000 מקדמים מבוארים המכילים מקטעי הגבלה נמשכו מספריות Hi-C על ידי הכלאה של גשושיות RNA בודדות 120-mer biotinylated באחד או בשני הקצוות של מקטע ההגבלה 34,72. שיטה זו אפשרה דיסקציה של האינטראקטום של אלפי מקדמים במספר גדל במהירות של סוגי תאים, כולל תאי גזע עובריים של עכברים, תאי כבד עובריים ואדיפוציטים 34,35,72,73, אך גם קווי לימפובלסטואידים אנושיים, אבות המטופויטיים, קרטינוציטים אפידרמיסים ותאים פלוריפוטנטיים 37,74,75,76,77 .
בהשוואה לטכנולוגיות העשרת מטרות אלה, Capture Hi-C מכוון לאזורים גנומיים רציפים עד לקנה מידה מגה-בסיס, ובכך משתרע על פני TAD אחד או יותר ומקיף נופים רגולטוריים של גנים. כל אזור העניין חייב להיות מרוצף עם מערך של בדיקות biotinylated המקיף כל אתר הגבלה DpnII בתוך המטרה. ההכלאה של מערך הביוטינילציה לתבנית 3C, לכידה מבוססת סטרפטווידין לאחר מכן ועיבוד לריצוף מרובב מבוצעים באמצעות מערכת העשרת מטרה עבור ריצוף מרובב אילומינה Paired-End. הפרוטוקול כולו מהיר, מכיוון שניתן לבצע אותו תוך שבוע מהכנת ספריית 3C ועד לריצוף NGS, והוא דורש רק התאמות קלות ו / או פתרון בעיות ספציפי בהתאמה אישית.
הפרוטוקול מספק גם יתרונות בהשוואה לשיטות מבוססות 3C אחרות. כדי לקבל מפות אינטראקציה ברזולוציה של 5-10 קילו-בתים, רצפנו 100-120 M קריאות קצה. לשם השוואה, השתמשנו כאן במערך נתונים Hi-C של 571 M קריאות כדי להגיע לרזולוציה של 20 KB64 (GSM2053973), ולפחות מיליארד קריאות יידרשו כדי להגיע לרזולוציה של 5 KB עם Hi-C22 רחב כרומוזומים.
לכידת Hi-C כפי שנעשה בה שימוש במחקר הנוכחי מגיעה לרזולוציה גבוהה בהרבה מזו של 5C שפורסם בעבר בהתבסס על אנזים הגבלת חותך 6 bp47 (טבלה משלימה 1). חשוב לציין, האסטרטגיה שנועדה להעשיר ולהעצים אינטראקציות ממוקדות ב-5C אינה מאפשרת ניתוח ספציפי לאלל של אינטראקציות כרומטין. נהפוך הוא, ניתן למפות את נתוני Capture Hi-C באופן ספציפי, ולאפשר דיסקציה של נופים מבניים תלת-ממדיים של זוגות כרומוזומים הומולוגיים, למשל בתאים אנושיים או בקווי תאים היברידיים F1 הנגזרים מחציית זני עכברים שונים גנטית78. כדי ליצור מפות אינטראקציה ספציפיות ללכידת Hi-C ברזולוציה של 5 קילו-בתים, ריצפנו קריאות מותאמות של 150 bp כדי להגדיל את כיסוי SNP. גישות ספציפיות לאלל דומות יכולות להיות מיושמות על קווי תאים אנושיים, שעבורם הביאור של SNPs זמין22.
חשוב לציין, למרות ש- Capture Hi-C מבטיח בדרך כלל רזולוציה גבוהה תוך שיפור הסבירות של עלויות ריצוף, לייצור אוליגונוקלאוטידים ביוטינילטים בהתאמה אישית יש השפעה על העלות הכוללת של שיטה זו. לכן, הבחירה של שיטת 3C המתאימה ביותר תהיה שונה עבור יישומים שונים, ויהיה תלוי בשאלה הביולוגית כי הוא מטופל ואת הפתרון הנדרש, כמו גם את גודל האזור של עניין. פרוטוקולי Capture Hi-C אחרים שפותחו חולקים תכונות מפתח עם הפרוטוקול המתואר כאן. לדוגמה, אסטרטגיית Capture Hi-C יושמה כדי לאפיין ~ 50 kb עד 1 Mb אזורים גנומיים המשתרעים על פני וריאנטים לא מקודדים הקשורים לסיכון לסרטן השד וסרטן המעי הגס; בפרוטוקול זה, אזורי המטרה נשלפו מספריות Hi-C על ידי הכלאה של פיתיונות RNA של 120 מר המרצפות את אזורי המטרה בכיסוי פי 3 33,38,79. באופן דומה, HYbrid Capture Hi-C (Hi-C 2) שימש למיקוד אינטראקציות בתוך אזורי עניין של עד2 Mb80. בשני הפרוטוקולים, השימוש בתבנית Hi-C מועשרת עבור מקטעי קשירה שנמשכו כלפי מטה של ביוטין הגדיל את אחוז הקריאות האינפורמטיביות הכולל בהשוואה לפרוטוקול שלנו. לדוגמה, במערך הנתונים Hi-C שבו השתמשנו כאן להשוואה64 (GSM2053973), אחוז הזוגות התקפים לאחר הסרת כפילויות גבוה פי 4.8 מהזוגות החוקיים שהתקבלו ב- Capture Hi-C כמתואר באיור 3 ובטבלה משלימה 1. עם זאת, המשיכה הרצופה של מקטעים קשורים ביוטינילטים וגשושיות היברידיות הופכת את הפרוטוקול למורכב יותר באופן משמעותי וגוזל זמן רב, תוך הפחתת המורכבות של האזור שנלכד.
שיטה זמינה נוספת להעשרת תבניות 3C בבדיקות אריחים היא Tiled-C, אשר יושמה לחקר ארכיטקטורת הכרומטין ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה במהלך התמיינות אריתרואידיםשל עכבר 43. ב-Tiled-C, פאנל של 70 bp biotinylated probes משמש להעשרת מגעים בתוך אזורים בקנה מידה גדול בשני סבבי לכידה רצופים כדי ליצור מפות ברזולוציה גבוהה מאוד של אינטראקציות ממוקדות 43,81. העשרת הלכידה הכפולה גם הופכת את הפרוטוקול לארוך ומורכב יותר בהשוואה ל- Capture Hi-C. עם זאת, בשונה מאסטרטגיות Capture-C המכוונות לאתרי הגבלה בודדים, ב- Tiled-C נראה כי הסבב השני של הלכידה אינו מגדיל באופן משמעותי את יעילות הלכידה, ולכן ניתן להשמיט אותו43. לבסוף, גישת ריצוף דומה המבוססת על אותה אסטרטגיית העשרת מטרה ששימשה במחקר זה יושמה על נתיחת נופים רגולטוריים הכוללים וריאנטים מבניים שתוארו בחולים עם מומים מולדים והונדסו מחדש בעכברים טרנסגניים41,42. במקרה זה, מערך הריצוף של הגשושיות תוכנן על פני המטרה כולה ולא בקרבת אתרי הגבלה DpnII41. אף על פי כן, עבודה זו הייתה מכרעת בהדגשת הרגישות והעוצמה של אסטרטגיה זו להשגת אפיון ברזולוציה גבוהה של אזורים גנומיים גדולים בהקשרים שונים41,42,48.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מייצג אסטרטגיה קלה, חזקה ורבת עוצמה לאפיון תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של כל אזורי העניין הגנומיים. יישום גישה זו על מערכות מודל שונות, סוגי תאים, נופי כרומטינים מווסתים התפתחותית ובקרת גנים בתנאים בריאים ופתולוגיים עשוי להקל על הבנתנו את יחסי הגומלין והסיבתיות בין טופולוגיית הגנום לבין בקרת גנים, אחת השאלות הפתוחות הבסיסיות בתחום האפיגנטיקה. יתר על כן, יישום Capture Hi-C כדי למפות אינטראקציות ארוכות טווח וקיפול כרומטין מסדר גבוה יותר של וריאנטים בסיכון שזוהו על ידי מחקרי GWAS יש פוטנציאל לחשוף את הרלוונטיות הפונקציונלית של אתרים גנומיים לא מקודדים הקשורים למחלות אנושיות בהקשרים שונים, ובכך לספק תובנות חדשות על התהליכים שעשויים להיות בבסיס הפתוגנזה.
The authors have nothing to disclose.
העבודה במעבדת הרד נתמכה על ידי פרס החוקר המתקדם של מועצת המחקר האירופית (XPRESS – AdG671027). א.ל. נתמכת על ידי מלגת מארי סקלודובסקה-קירי לפעולות אינדיבידואליות של האיחוד האירופי (IF-838408). A.H. נתמכת על ידי הרשת החדשנית והבינתחומית של ITN ChromDesign, במסגרת הסכם מענק מארי סקלודובסקה-קירי 813327. המחברים מודים לדניאל איברהים (MPI לגנטיקה מולקולרית, ברלין) על ייעוץ טכני מועיל, לפלטפורמת NGS במכון קירי (פריז), ולוולדימיר בנס ולמתקן הליבה הגנומית ב- EMBL (היידלברג), על התמיכה והסיוע.
10x PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
37% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15686 | single use glass-vials; do not reuse |
50 mL PP conical tube | Falcon | 352070 | |
Agarose | Sigma | A9539-500g | |
Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
Cell Scrapers – 25 cm Handle and 3.0 cm Blade | Falcon | 353089 | |
CHIR99021 | Axon Medchem BV | Axon 1386 | |
cOmplete Mini, Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Merck | 11836170001 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
Countess II FL | Invitrogen | ZGEXSCCOUNTESS2FL | Automated cell counter |
Covaris S2 | Covaris | 500217 | Sonicator |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
DpnII (50000 units/mL) | New England Biolabs | R0543M | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Merck | D6429 | |
Ethanol (100%) | Merck | 1.00983.2500 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
gelatine from porcine skin | Sigma | G1890 | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
GlycoBlue | Thermo Scientific | AM9516 | Coprecipitant |
High-Sensitivity Bioanlayzer chips | Agilent | 5067-4626 | |
Large Cooling Centrifuge 5920 R | Eppendorf | 5948000018 | |
leukaemia inhibitory factor (LIF) | Merck | ESG1107 | |
Liquiport | KNF | NF300 | Benchtop aspiration system |
Low-binding filter tips | Biozym | VT0260U, VT0240, VT0220, VT0200U | |
Molecular biology grade water | Merck | W3500-6x500ML | |
Next Seq 500 | Illumina | SY-415-1001 | |
Next Seq 500 High Output v2 Kit (300 cycles) | Illumina | FC-404-2004 | |
Nonidet P40 Substitute (NP40) | Merck | 11332473001 | |
PD0325901 | Axon Medchem BV | Axon 1408 | |
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Merck | 11873580001 | |
Proteinase K – recombinant, PCR-grade (20 mg/mL) | Thermo Scientific | EO0491 | |
Qubit 2.0 | Thermo Scientific | Q32871 | |
Qubit assay tubes | Thermo Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA High Sensitivity kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
RNase A (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | |
Sodium acetate pH 5.2 (3M) | Merck | S7899 | |
speed vacuum concentrator | Eppendorf | EP5305000100-1EA | |
Agencourt AMPureXP | Beckman Coulter | A63881 | SPRI beads |
SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent | 5190-8645 | |
SureSelect Target Enrichment Kit ILM Indexing Hyb Module Box 2 | Agilent | 5190-4455 | |
SureSelect XT Library Prep Kit ILM | Agilent | 5500-0132 | |
T4 ligase (30 units/µL) | Thermo Scientific | EL0013 | |
table-top Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000012 | |
Triton-X-100 (500 mL) | Merck | X100-500ML | |
Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
Trypsine | Thermo Scientific | 25300054 | |
UltraPure Glycine | Thermo Scientific | 15527013 | |
β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 31350010 |