解剖学的に特異的な単一細胞遺伝子発現法による依存行動における反報酬の要因の調査

依存症は依然として先進国で増大する課題です^1,2。科学的および臨床的大きな進歩にもかかわらず、依存症の割合は増加し続けていますが、確立された治療法の有効性はせいぜい^{安定しています3,4,5}。しかし、バイオテクノロジーと科学的アプローチの進歩は、物質依存の病態生理学をさらに調査するための新しい方法と仮説をもたらしました^6,7,8。実際、最近の進展は、新しい概念と治療パラダイムが社会的、経済的、政治的結果を伴うブレークスルーにつながる可能性があることを示唆しています9,10,11,12。

アルコールの離脱とオピオイド依存症における反報酬を調査した^13,14,15,16。メソッドはこのパラダイム^{の中心です17,18}。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)は、解剖学的特異性の高い単一細胞を選択できます。この機能は、グリアとニューロンの両方を同じ動物の同じニューロン亜核から収集および分析できるため、神経炎症反報酬仮説に不可欠です^13、14、15、^16、19。次に、選択された細胞のトランスクリプトームの関連部分を、ハイスループットマイクロ流体逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)で測定することができ、機能ネットワークへの洞察をもたらす計算分析のための高次元データセットを提供する^20,21。

特定の脳核のニューロンとグリアのトランスクリプトームのサブセットを測定すると、サンプル数と測定された遺伝子の両方で堅牢で、感度と特異的なデータセットが生成されます。これらのツールは、グリア、主に星状細胞とミクログリアが過去10年間に神経疾患および精神疾患の中心的な役割を示してきたため、精神疾患に対するシステムの神経科学的アプローチに最適です^22,23。私たちのアプローチは、局所的なパラクリンシグナル伝達に関与する多数の受容体とリガンドにわたって同時にグリアとニューロンの発現応答を測定することができます。実際、シグナリングは、ファジィ論理²⁴などの様々な定量的方法を用いて、これらのデータセットから推論することができる。さらに、ニューロンまたはグリアにおける細胞サブ表現型とその機能の同定は、特定の核の脳細胞が単一細胞レベルでどのように組織化、応答、および調節不全になるかについての洞察を提供することができます。この機能システムのダイナミクスは、時系列実験¹⁶でモデル化することもできます。最後に、動物モデルを解剖学的または薬理学的に摂動して、このシステムのアプローチに機構的状態を与えることができます。

代表的な実験:
以下に、これらの方法の適用例を示します。この研究では、アルコール依存とその後の離脱に応答した孤立核(NTS)におけるラットのニューロンおよびミクログリア遺伝子発現を調査しました¹⁶。ラットコホートは、1)対照、2)エタノール依存性(EtOH)、3)8時間離脱(Wd)、4)32時間Wd、および5)176時間Wdから構成されていました(図1A)。急速な断頭に続いて、脳幹を前脳から分離して凍結切片化し、チロシンヒドロキシラーゼ陽性(TH+)ニューロンおよびミクログリアについてスライスを染色した(図1B)。LCMは、TH+およびTH-ニューロンおよびミクログリアの両方を収集するために使用されました。すべての細胞はNTSからのものであり、10細胞プールのサンプルとして分析されました。4つの96 x 96マイクロ流体RT-qPCRダイナミックアレイを、65個の遺伝子を測定するRT-qPCRプラットフォームで実行しました(図1B-C)。データは-_ΔΔCT法を用いて正規化し、Rを用いて解析し、単一細胞選択を分子マーカーで検証した(図1D-E)。技術的検証は、単一のバッチ内およびバッチ間で分析された技術反復によってさらに検証されました(図2および図3)。TH+ニューロンとTH-ニューロンは、炎症性遺伝子クラスターは類似しているがγ-アミノ酪酸(GABA)受容体(R)クラスターが異なる異なるサブ表現型に編成されています(図4および図5)。炎症性遺伝子クラスターの発現が上昇したサブ表現型は32時間Wdで過剰発現したが、GABA受容体(GABAR)発現は長期のアルコール離脱(176時間Wd)で低いままであった。この研究は、離脱中の内臓からの傍受的フィードバックが内臓感情神経核(すなわち、NTSおよび扁桃体)の調節不全に寄与し、より重度の自律神経および感情的後遺症をもたらし、物質依存に寄与すると推測するアルコールおよびオピオイド依存の反報酬仮説に貢献しています(図6)。