Summary

FACS-изоляция и культура фибро-адипогенных предшественников и мышечных стволовых клеток из невозмутимых и поврежденных скелетных мышц мыши

Published: June 08, 2022
doi:

Summary

Точная идентификация фибро-адипогенных клеток-предшественников (FAPs) и мышечных стволовых клеток (MuSC) имеет решающее значение для изучения их биологической функции в физиологических и патологических состояниях. Этот протокол содержит рекомендации по выделению, очистке и культивированию ФАПов и MUSC из мышц взрослых мышей.

Abstract

Фибро-адипогенные клетки-предшественники (ФАП) представляют собой популяцию скелетных мышечных мезенхимальных стромальных клеток (МСК), способных дифференцироваться по фиброгенной, адипогенной, остеогенной или хондрогенной линии. Вместе с мышечными стволовыми клетками (MuSC) FAP играют решающую роль в гомеостазе мышц, восстановлении и регенерации, активно поддерживая и реконструируя внеклеточный матрикс (ECM). При патологических состояниях, таких как хронические повреждения и мышечные дистрофии, ФАП подвергаются аберрантной активации и дифференцируются в коллаген-продуцирующие фибробласты и адипоциты, что приводит к фиброзу и внутримышечной жировой инфильтрации. Таким образом, ФАП играют двойную роль в регенерации мышц, либо поддерживая оборот MuSC и способствуя восстановлению тканей, либо способствуя образованию фиброзных рубцов и внематочных жировых инфильтратов, которые ставят под угрозу целостность и функцию скелетной мышечной ткани. Правильная очистка ФАПов и MuSC является необходимым условием для понимания биологической роли этих клеток как в физиологических, так и в патологических состояниях. Здесь мы описываем стандартизированный метод одновременного выделения FAP и MuSC из мышц конечностей взрослых мышей с использованием флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Протокол подробно описывает механическую и ферментативную диссоциацию мононуклеарных клеток из целых мышц конечностей и травмированных передних (ТА) мышц большеберцовой кости. FAP и MuSC впоследствии изолируются с помощью полуавтоматического клеточного сортировщика для получения чистых клеточных популяций. Дополнительно описан оптимизированный метод культивирования покоящихся и активированных ФАПов и MUSC, либо отдельно, либо в условиях кокультуры.

Introduction

Скелетная мышца является самой большой тканью в организме, на которую приходится ~ 40% веса взрослого человека, и отвечает за поддержание осанки, создание движения, регулирование базального энергетического обмена и температуры тела1. Скелетные мышцы являются очень динамичной тканью и обладают замечательной способностью адаптироваться к различным раздражителям, таким как механическое напряжение, метаболические изменения и ежедневные факторы окружающей среды. Кроме того, скелетная мышца регенерирует в ответ на острую травму, что приводит к полному восстановлению ее морфологии и функций2. Пластичность скелетных мышц в основном зависит от популяции резидентных мышечных стволовых клеток (MuSC), также называемых сателлитными клетками, которые расположены между плазматической мембраной миофибры и базальной пластинкой 2,3. В нормальных условиях MuSC находятся в мышечной нише в состоянии покоя, с несколькими делениями, чтобы компенсировать клеточный оборот и пополнить пул стволовых клеток4. В ответ на травму MuSC входят в клеточный цикл, размножаются и либо способствуют образованию новых мышечных волокон, либо возвращаются в нишу в процессе самообновления 2,3. В дополнение к MuSC, гомеостатическое поддержание и регенерация скелетных мышц полагаются на поддержку популяции мышечных резидентных клеток, называемых фибро-адипогенными предшественниками (FAPs)5,6,7. ФАП представляют собой мезенхимальные стромальные клетки, встроенные в мышечную соединительную ткань и способные дифференцироваться по фиброгенной, адипогенной, остеогенной или хондрогенной линии 5,8,9,10. FAP обеспечивают структурную поддержку MuSC, поскольку они являются источником белков внеклеточного матрикса в нише мышечных стволовых клеток. FAP также способствуют долгосрочному поддержанию скелетных мышц путем секреции цитокинов и факторов роста, которые обеспечивают трофическую поддержку миогенеза и роста мышц 6,11. При остром мышечном повреждении ФАП быстро размножаются, образуя переходную нишу, которая поддерживает структурную целостность регенерирующей мышцы и обеспечивает благоприятную среду для поддержания пролиферации и дифференцировки MUSC паракринным способом5. По мере продолжения регенерации ФАПы очищаются от регенеративной мышцы апоптозом, и их количество постепенно возвращается к базальному уровню12. Однако в условиях, благоприятствующих хроническому повреждению мышц, FAP перекрывают проапоптотическую сигнализацию и накапливаются в мышечной нише, где они дифференцируются в коллаген-продуцирующие фибробласты и адипоциты, что приводит к инфильтратам эктопического жира и образованию фиброзных рубцов12,13.

Из-за их мультипотентности и регенеративных способностей FAP и MuSC были идентифицированы как перспективные мишени в регенеративной медицине для лечения заболеваний скелетных мышц. Поэтому для исследования их функции и терапевтического потенциала важно установить эффективные и воспроизводимые протоколы для выделения и культивирования ФАПов и MUSC.

Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) может идентифицировать различные клеточные популяции на основе морфологических характеристик, таких как размер и гранулярность, и позволяет выделять специфические клетки на основе использования антител, направленных против маркеров клеточной поверхности. У взрослых мышей MuSC экспрессируют молекулу адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM-1, также известную как CD106)14,15 и α7-интегрин15, в то время как FAP экспрессируют рецептор фактора роста тромбоцитов α (PDGFRα) и антиген стволовых клеток 1 (Sca1 или Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . В описанном здесь протоколе MuSC были идентифицированы как CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, в то время как FAP были идентифицированы как CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Альтернативно, мыши PDGFRαEGFP использовали для выделения FAP как CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-events18,19. Кроме того, мы сравнили перекрытие между флуоресцентным сигналом клеток PDGFRα-GFP+ с клетками, идентифицированными поверхностным маркером Sca1. Наш анализ показал, что все GFP-экспрессирующие клетки также были положительными для Sca1, что указывает на то, что любой подход может быть использован для идентификации и изоляции FAP. Наконец, окрашивание специфическими маркерными антителами подтвердило чистоту каждой клеточной популяции.

Protocol

Все проведенные эксперименты на животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию (ACUC) Национального института артрита, опорно-двигательного аппарата и кожных заболеваний (NIAMS). Исследов…

Representative Results

Этот протокол позволяет выделить около одного миллиона FAP и до 350 000 MuSC из неповрежденных задних конечностей взрослых мышей дикого типа (3-6 месяцев), что соответствует выходу 8% для FAP и 3% для MuSC от общего числа событий. При сортировке клеток из поврежденных ТА через 7 дней после травмы две-т?…

Discussion

Создание эффективных и воспроизводимых протоколов для идентификации и изоляции чистых популяций взрослых стволовых клеток является первым и наиболее важным шагом на пути к пониманию их функции. Изолированные FAP и MuSC могут быть использованы для проведения мультиомического анализа в э…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Тома Чунга (Гонконгский университет науки и технологии) за советы по изоляции MuSC. Эта работа финансировалась NIAMS-IRP через гранты NIH AR041126 и AR041164.

Materials

5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
20 G BD Needle 1 in. single use, sterile BD Biosciences  305175
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) The University of British Columbia 53-0010-01
APC anti-mouse CD31 Antibody BioLegend 102510
APC anti-mouse CD45 Antibody BioLegend 103112
BD FACSMelody Cell Sorter BD Biosciences 
BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL BD Biosciences  309604
Biotin anti-mouse CD106 Antibody BioLegend 105703
C57BL/6J  mouse (Female and Male) The Jackson Laboratory 000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse The Jackson Laboratory 007669
Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356400
Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356500
Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356408
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile VWR 414004-265
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11055
Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile Corning 352340
Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile Corning 353002
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL VWR 352196
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL Corning 352070
Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning VWR 60819-728
Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning VWR 21008-948
Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) Promega G5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, powder ThermoFisher Scientific 17101015
Gibco Dispase, powder ThermoFisher Scientific 17105041
Gibco DMEM, high glucose, HEPES ThermoFisher Scientific 12430054
Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States ThermoFisher Scientific 16000044
Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix ThermoFisher Scientific 11550043
Gibco Horse Serum, New Zealand origin ThermoFisher Scientific 16050122
Gibco PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
Gibco PBS (10x), pH 7.4 ThermoFisher Scientific 70011044
Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) ThermoFisher Scientific 10378016
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A-21127
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools Inc 14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) ThermoFisher Scientific A1310
Mouse PDGF R alpha Antibody R&D Systems AF1062
Normal Donkey Serum Fisher Scientific NC9624464
Normal Goat Serum ThermoFisher Scientific 31872
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody BioLegend 108120
Paraformaldehyde, 16% Fisher Scientific NCC0528893
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
PE/Cyanine7 Streptavidin BioLegend 405206
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools Inc 91500-09
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools Inc 91150-20
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

Referenzen

  1. Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
  2. Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
  3. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
  4. Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
  5. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
  6. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  7. Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
  8. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  9. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  10. Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
  11. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
  12. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  13. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
  14. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  15. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
  16. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
  17. Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
  18. Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
  19. Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
  20. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
  21. Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
  22. García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  23. Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
  24. Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  25. Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Entwicklungsbiologie. 326 (1), 47-59 (2009).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (184), e63983, doi:10.3791/63983 (2022).

View Video