Denne protokollen beskriver størrelseseksklusjonskromatografi, en lettvint og reproduserbar teknikk for å berike Mycobacterium tuberculosis ekstracellulære vesikler fra dyrkningssupernatanter.
Rollen til ekstracellulære vesikler (EV) i sammenheng med bakteriell infeksjon har dukket opp som en ny vei for å forstå mikrobiell fysiologi. Spesielt spiller Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV en rolle i vertspatogeninteraksjonen og responsen på miljøstress. Mtb-elbiler er også svært antigene og viser potensial som vaksinekomponenter. Den vanligste metoden for rensing av MTB-elbiler er tetthetsgradient ultrasentrifugering. Denne prosessen har flere begrensninger, inkludert lav gjennomstrømning, lavt utbytte, avhengighet av dyrt utstyr, tekniske utfordringer, og det kan påvirke den resulterende forberedelsen negativt. Størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) er en mildere alternativ metode som bekjemper mange av begrensningene ved ultrasentrifugering. Denne protokollen viser at SEC er effektiv for Mtb EV-anrikning og produserer Mtb EV-preparater av høy kvalitet med økt utbytte på en rask og skalerbar måte. I tillegg demonstrerer en sammenligning med tetthetsgradient ultracentrifugering ved kvantifiserings- og kvalifiseringsprosedyrer fordelene med SEC. Mens evalueringen av EV-mengde (nanopartikkelsporingsanalyse), fenotype (transmisjonselektronmikroskopi) og innhold (Western blotting) er skreddersydd for MTB EV, kan arbeidsflyten som tilbys brukes på andre mykobakterier.
Frigjøring av ekstracellulære vesikkel (EV) av patogener kan være nøkkelen til å låse opp ny teknologi for å kontrollere smittsomme sykdommer1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) er et patogen av høy konsekvens, infiserer omtrent en tredjedel av verdens befolkning og krever livet til millioner av mennesker hvert år2. EV-produksjon av Mtb er godt dokumentert, men likevel unnvikende i biogenesen og varierte roller (dvs. immunostimulerende, immunosuppressiv, jern og næringsoppkjøp) av disse EV-ene i forbindelse med infeksjon 3,4,5. Forsøk på å forstå sammensetningen av Mtb EV avslørte 50-150 nm lipidmembranlukkede kuler avledet fra plasmamembranen som inneholder lipider og proteiner av immunologisk betydning 3,6. Undersøkelse av rollen til MTB EV i bakteriell fysiologi har avslørt betydningen av bakteriell EV-modulering som svar på miljøstress for overlevelse5. Host-patogen interaksjonsstudier har vært mer kompliserte å tolke, men bevis indikerer at Mtb EV kan påvirke immunresponsen til verten og potensielt kan tjene som en effektiv vaksinasjonskomponent 3,4,7.
De fleste studier av MTB-elbiler så langt har basert seg på tetthetsgradient ultrasentrifugering for vesikkelberikelse8. Dette har vært effektivt for småskala studier; Denne teknikken har imidlertid flere tekniske og logistiske utfordringer. Alternative arbeidsflyter par multistep sentrifugering, for fjerning av hele celler og store rusk, med en siste ultracentrifugation trinn til pellet EV. Denne metoden kan variere i effektivitet, og resulterer ofte i lavt utbytte og korensing av løselige ikke-vesikkelassosierte biomolekyler samtidig som den påvirker vesikkelategritet9. I tillegg er denne prosessen tidkrevende, manuelt intensiv og svært begrenset i gjennomstrømning på grunn av utstyrsbegrensninger.
Denne protokollen beskriver en alternativ teknikk til tetthetsgradient ultrasentrifugering: størrelseseksklusjonskromatografi (SEC). Denne metoden har blitt demonstrert for miljømykobakterier, og i det nåværende arbeidet har den blitt ekstrapolert til Mtb10. En kommersielt tilgjengelig kolonne- og automatisk fraksjonssamler kan forbedre konsistensen i vesisk forberedelse og redusere behovet for spesifikt, dyrt utstyr. Det er også mulig å fullføre denne protokollen på en brøkdel av tiden sammenlignet med tetthetsgradient ultracentrifugation, noe som øker gjennomstrømningen. Denne teknikken er mindre teknisk utfordrende, noe som gjør det lettere å mestre, og kan øke inter / intra-laboratoriet reproduserbarhet. Endelig har SEC høy separasjonseffektivitet og er mild, og bevarer vesiklernes integritet.
Mycobacterium tuberculosis ekstracellulære vesikler er svært antigene reservoarer, som presenterer dem som en attraktiv vei for å utvikle diagnostiske verktøy og fremtidige vaksiner 4,19,20. Historisk sett har tetthetsgradient ultrasentrifugering blitt brukt til å skille Mtb-elbiler fra andre løselige, utskilte materialer8. Selv om denne prosessen er effektiv, er den også tidkrevende, tekn…
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å anerkjenne støtte fra College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award og College Research Council Shared Research Program til NKG og finansiering av ATCC (award # 2016-0550-0002) til KMD. Vi ønsker også å anerkjenne Anne Simpson for teknisk støtte og BEI Resources, NIAID, NIH for følgende reagenser: Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (produsert in vitro), NR-13792, Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produsert in vitro), NR-49223 og Monoklonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produsert in vitro), NR-13811.
20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
96 well plate | Corning | 15705-066 | |
Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
Centricon Plus – 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |